專利名稱：一種酶調控的納米超分子囊泡的制備方法及應用的制作方法
一種酶調控的納米超分子囊泡的制備方法及應用
技術領域：
本發明屬于納米超分子材料技術領域，特別是一種酶調控的納米超分子囊泡的制備方法及應用。
背景技術：
刺激響應囊泡因其在化學、生物和材料科學領域有著諸多重要的應用在近些年受到了廣泛的關注(A. Mueller, D. F. O ' Brien. Chem. Rev. 2002，102，727-757 ； (2)
D.M. Vriezema, M. C. Aragones，J. A. A. W. Elemans，J. J. L. M. Cornelissen，A. E. Rowan, R. J. M. Nolte. Chem. Rev. 2005，105，1445-1489 ； (3) X. Guo, F. C. Szoka. Acc. Chem. Res. 2003， 36,335-341.)。刺激響應囊泡的藥物/基因傳遞體系由于可以將負載物在特定位點靶向地進行釋放而成為其中的一個研究熱點，因為這不但可以提高負載物的藥效，而且可以降低其毒副作用。目前報道的刺激響應囊泡大多是對外界光、電、熱和PH等刺激進行響應的體系(M. Lee, S. -J. Lee, L. -H. Jiang. J. Am. Chem. Soc. 2004，126，12724-12725 ； (2)
C.Wang, Q. Chen, H. Xu, Z. Wang, X. Zhang. Adv. Mater. 2010, 22, 2553-2555 ; (3) A. Napoli， M.Valentini, N.Tirelli, M. Muller, J. A. HubbelI. Nat. Mater. 2004，3，183-189 ； (4)
E.Kim, D. Kim, H. Jung, J. Lee, S. Paul, N. Selvapalam, Y. Yang, N. Lim, C. G. Park, K. Kim. Angew. Chem.，Int. Ed. 2010，49，4405-4408.)，而對于酶信號進行響應的囊泡體系還并不多見(C. Wang, Q. Chen, Z. Wang, X. Zhang. Angew. Chem. Int. Ed. 2010，49，8612-8615.)。酶響應信號不但是生物相容的，而且具有高的選擇性，此外許多疾病都與酶的非正常活性有關 (Z. Yang, G. Liang, B. Xu. Acc. Chem. Res. 2008，41，315-326.)，因而設計酶響應囊泡的藥物傳遞體系將負載的藥物在特定酶的靶向位點進行釋放具有重大的意義和廣闊的應用前景。然而，酶響應位點的引入通常需要復雜和耗時的共價鍵合成，這不但提高了制備成本，而且還會將有機溶劑和毒性試劑在合成過程中引入到囊泡體系從而降低了其生物兼容性。超分子手段是除共價鍵手段外的另一種構筑刺激響應囊泡的方法(Y.Wang，H. Xu, X. Zhang. Adv. Mater. 2009,21, 2849-2864 ； (2) X. Zhang, C. Wang. Chem. Soc. Rev. 2011,40, 94-101.)。刺激響應位點可以通過非共價鍵相互作用的方式引入到囊泡體系中來，從而避免了共價鍵的化學合成。

發明內容本發明的目的是針對上述技術分析，提供一種酶調控的納米超分子囊泡的制備方法及應用，該超分子囊泡系基于磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿二元超分子組裝的酶調控囊泡，磺化杯[4]芳烴的存在可以誘導氯化肉豆蘧酰膽堿的臨界聚集濃度下降大約100倍；該超分子囊泡是生物相容的且具有很好的穩定性，此外該超分子囊泡對膽堿酯酶具有良好的選擇響應性；該超分子囊泡可以負載治療老年癡呆癥的親水藥物他克林 (tacrine)，負載后的他克林可以高選擇性并且適量的釋放于膽堿酯酶的靶向位點。本發明的技術方案
一種酶調控的納米超分子囊泡，其構筑單元以磺化杯[4]芳烴(C4AS)為主體，以氯化肉豆蘧酰膽堿(MyCl)為客體，通過主-客體包結配位相互作用構筑超分子組裝體，其構筑過程如圖14所示。—種所述酶調控的納米超分子囊泡的制備方法，將磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿溶解于水中，均勻混合后得到超分子囊泡溶液，然后加入膽堿酯酶使超分子囊泡溶液中的超分子囊泡隨時間逐漸解聚即可。所述超分子囊泡溶液中磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿的濃度分別為 O. OImmoI /I,和 O. 10mmol /I,η所述膽堿酯酶為丁酰膽堿酯酶，丁酰膽堿酯酶在超分子囊泡溶液中的濃度為
O.5U/mL。一種所述酶調控的納米超分子囊泡的應用，將治療老年癡呆癥的親水藥物他克林負載到超分子囊泡的空腔內。本發明的優點是基于磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿二元超分子組裝構筑的納米超分子囊泡，制備方法簡便，主、客體原料用量少；該超分子囊泡生物相容且具有很好的穩定性；該超分子囊泡對膽堿酯酶具有良好的選擇響應性；該超分子囊泡可以負載治療老年癡呆癥的親水藥物他克林，負載后的他克林可以高選擇性并且適量的釋放于膽堿酯酶的靶向位點，其在治療老年癡呆癥藥物負載、運輸和靶向釋放領域具有廣闊的應用前景。

圖I為磺化杯[4]芳烴存在下氯化肉豆蘧酰膽堿的臨界聚集濃度圖。圖2為磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿超分子組裝的酶響應囊泡的動態光散射圖。圖3為磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿超分子組裝的酶響應囊泡的低溫透射電子顯微鏡圖像。圖4為構筑的磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿組裝的超分子囊泡體系450nm 波長處透光率隨時間變化的曲線圖。圖5為磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿超分子組裝的酶響應囊泡和L02細胞 (人體正常肝細胞)進行孵化后連續記錄四天的和空白對照組對比的活細胞數量圖。圖6為磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿超分子組裝的酶響應囊泡和L02細胞 (人體正常肝細胞)進行孵化后連續記錄四天的和空白對照組對比的活細胞形態圖。圖7為往構筑的磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿組裝的超分子囊泡體系中加入丁酰膽堿酯酶導致體系450nm波長處透光率隨時間變化的曲線圖。圖8為往構筑的磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿組裝的超分子囊泡體系中加入丁酰膽堿酯酶三小時后體系光散射強度的變化圖。圖9為往構筑的磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿組裝的超分子囊泡體系中加入丁酰膽堿酯酶三小時后的高分辨透射電子顯微鏡圖像。圖10為往構筑的磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿組裝的超分子囊泡體系中加入O. 5U/mL堿性磷酸脂酶導致體系450nm波長處透光率隨時間變化的曲線圖。圖11為往構筑的磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿組裝的超分子囊泡體系中加入O. 5U/mL核酸外切酶I導致體系450nm波長處透光率隨時間變化的曲線圖。圖12為往構筑的磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿組裝的超分子囊泡體系中加入O. 5U/mL葡萄糖氧化酶導致體系450nm波長處透光率隨時間變化的曲線圖。圖13為往構筑的磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿組裝的超分子囊泡體系中加入丁酰膽堿酯酶，以及往構筑的負載他克林的磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿組裝的超分子囊泡體系中加入等量的丁酰膽堿酯酶和去活的丁酰膽堿酯酶后導致體系450 nm 波長處透光率隨時間變化的曲線圖。圖14為該納米超分子囊泡構筑過程示意圖。
具體實施方式實施例一種酶調控的納米超分子囊泡的制備方法，將C4AS和MyCl溶解于水中并均勻混合即可制得超分子囊泡溶液，所述C4AS和MyCl的濃度分別為O. Olmmol/L和O. lOmmol/L。在沒有C4AS存在下MyCl的臨界聚集濃度為2. 5mM (M. Wang, X. Gu, G. Zhang,
D.Zhang, D. Zhu. Anal. Chem. 2009,81,4444-4449.);如圖 I 所不，橫化杯[4]芳經的存在可以誘導氯化肉豆蘧酰膽堿的臨界聚集濃度下降約100倍。(I)該超分子囊泡的粒徑和形貌分別通過動態光散射和低溫透射電子顯微鏡所表征，圖2為磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿超分子組裝的酶響應囊泡的動態光散射圖；圖3為磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿超分子組裝的酶響應囊泡的低溫透射電子顯微鏡圖像。圖4為構筑的磺化杯芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿組裝的超分子囊泡體系450nm波長處透光率隨時間變化的曲線圖，圖中顯示該超分子囊泡在450nm波長處的透光率隨時間不發生變化，表明該超分子囊泡具有很好的穩定性。如圖5所示，磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿超分子組裝的酶響應囊泡和L02 細胞(人體正常肝細胞)進行孵化后連續記錄四天的活細胞數量和空白對照組對比均無統計學差異。如圖6所示，磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿超分子組裝的酶響應囊泡和 L02細胞(人體正常肝細胞)進行孵化后連續記錄四天的和空白對照組對比的活細胞形態也無明顯變化。圖5和圖6表明該超分子囊泡是生物相容的。(2)該超分子囊泡的丁酰膽堿酯酶高選擇響應性的實驗驗證I)圖7為往構筑的磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿組裝的超分子囊泡體系中加入丁酰膽堿酯酶導致體系450nm波長處透光率隨時間變化的曲線圖，圖中表明在超分子囊泡溶液中加入丁酰膽堿酯酶，導致其在450nm波長處透光率隨時間逐漸升高，最后可達到96%以上，證明了加入正常生理量的丁酰膽堿酯酶(0.5U/mL)即可使囊泡隨時間逐漸完全解聚；圖8為往構筑的磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿組裝的超分子囊泡體系中加入丁酰膽堿酯酶三小時后體系光散射強度的變化圖，圖中表明加入丁酰膽堿酯酶三小時后體系光散射強度劇烈下降，同樣證實了囊泡的解聚。體系加入丁酰膽堿酯酶三小時后的高分辨透射電子顯微鏡圖像，如圖9所示，也證實了囊泡的完全解聚。2)對比試驗在超分子囊泡溶液中加入堿性磷酸脂酶、核酸外切酶I以及葡萄糖氧化酶，體系在450nm波長處的透光率隨時間不發生變化，如圖10、圖11、圖12所示，表明加入其它類型的酶不能像加入膽堿酯酶一樣可以使囊泡隨時間逐漸解聚。一種上述酶調控的納米超分子囊泡的應用，將親水的治療老年癡呆癥的藥物他克林負載到制備的超分子囊泡的空腔內，方法如下I)將他克林、C4AS和MyCl溶解于水中后混合均勻得到溶液,將該溶液離心和透析后即可制得他克林負載的超分子囊泡，所述他克林、C4AS和MyCl的濃度分別為50nmol/L，
O.01mmol/L 和 O. 10mmol /I,；2)向構筑的磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿組裝的超分子囊泡體系中加入丁酰膽堿酯酶，另外向構筑的負載他克林的磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿組裝的超分子囊泡體系中加入等量的丁酰膽堿酯酶和去活的丁酰膽堿酯酶后導致體系450nm波長處透光率隨時間變化，如圖13所示，表明負載后的他克林可以高選擇性并且適量的釋放于膽堿酯酶的靶向位點。負載他克林的囊泡在沒有膽堿酯酶活性的位點不能解聚，說明負載的藥物只可在活性膽堿酯酶靶向位點高選擇性的進行釋放；和未負載藥物的囊泡相比，負載他克林的囊泡在膽堿酯酶活性位點解聚的程度大大下降，說明負載的藥物可以根據需要適量的釋放于活性膽堿酯酶靶向位點，避免了藥物的過量使用。
權利要求
1.一種酶調控的納米超分子囊泡，其特征在于構筑單元以磺化杯[4]芳烴(C4AS)為主體，以氯化肉豆蘧酰膽堿(MyCl)為客體，通過主-客體包結配位相互作用構筑超分子組裝體，其構筑過程如圖14所示。
2.一種如權利要求I所述酶調控的納米超分子囊泡的制備方法，其特征在于將磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿溶解于水中，均勻混合后得到超分子囊泡溶液，然后加入膽堿酯酶使超分子囊泡溶液中的超分子囊泡隨時間逐漸解聚即可。
3.根據權利要求2所述酶調控的納米超分子囊泡的制備方法，其特征在于所述超分子囊泡溶液中磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蘧酰膽堿的濃度分別為O. Olmmol/L和O. IOmmol/ L0
4.根據權利要求2所述酶調控的納米超分子囊泡的制備方法，其特征在于所述膽堿酯酶為丁酰膽堿酯酶，丁酰膽堿酯酶在超分子囊泡溶液中的濃度為O. 5U/mL。
5.一種如權利要求I所述酶調控的納米超分子囊泡的應用，其特征在于將治療老年癡呆癥的親水藥物他克林負載到超分子囊泡的空腔內。
全文摘要
一種酶調控的納米超分子囊泡，其構筑單元以磺化杯[4]芳烴(C4AS)為主體，以氯化肉豆蔻酰膽堿(MyCl)為客體，通過主-客體包結配位相互作用構筑超分子組裝體；其制備方法將磺化杯[4]芳烴和氯化肉豆蔻酰膽堿溶解于水中，均勻混合后得到超分子囊泡溶液，然后加入膽堿酯酶使超分子囊泡溶液中的超分子囊泡隨時間逐漸解聚即可。本發明的優點是該制備方法簡便，主、客體原料用量少；該超分子囊泡生物相容且穩定性好，對膽堿酯酶具有良好的選擇響應性，可負載治療老年癡呆癥的親水藥物他克林，負載后的他克林可高選擇性并且適量的釋放于膽堿酯酶的靶向位點，其在治療老年癡呆癥藥物負載、運輸和靶向釋放領域具有廣闊的應用前景。
文檔編號A61K47/20GK102580100SQ20111043034
公開日2012年7月18日 申請日期2011年12月19日 優先權日2011年12月19日
發明者劉育, 王以軒, 王魁, 郭東升 申請人:南開大學