專利名稱：：一種抗異質性及多因性老年癡呆藥物篩選模型的建立及應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種抗異質性及多因性老年癡呆藥物篩選模型的建立及應用。
背景技術：
：老年癡呆發病機制和病變過程是復雜的，現有的每一種動物模型僅在一定程度上或某些方面模擬了老年癡呆動物的癥狀和病理改變。要尋找一種能夠完全模擬老年癡呆全部臨床和病理特征的動物模型極為困難，從經濟上講也沒有必要。由于在臨床癡呆人群中，混合性癡呆具有較高的流行趨勢，使得人們將老年性癡呆(AlzheimerDisease,AD)與血管性癡呆(VascularDementia,VD)結合起來。而與之相關的AD及VD癡呆動物模型制作一直是該領域的難點及熱點之一，現有的模型制備往往將兩者嚴格區分開來，而且大多只針對疾患病理特征的某一方面(即模擬諸多病理變化中的某一個方面)，而忽視了老年期癡呆的異質性及多因性。目前發現衰老及腦低灌注狀態是AD及VD發病過程中不可缺少的兩大主要因素，而淀粉樣蛋白(amyloid!3-protein，AJ3)是老年斑的主要成分，也是AD的病理特征之一。本發明擬從AD和VD發病的多因性及相似性出發，嘗試將腦衰老及血管危險因子(心臟病、中風、高血壓、低血壓、動脈粥樣硬化和短暫性腦缺血發作等)導致的腦低灌注和腦病理病變等相結合，利用腹腔注射半乳糖促老化與反復結扎雙側頸總動脈致腦低灌注及大鼠側腦室一次性注射(3淀粉樣蛋白4nmo1制作癡呆模型的方法，為老年期AD、VD及混合性癡呆的發病機制和相關藥物療效研究提供一種學習、記憶功能減退老齡大鼠模型，并通過Morris水迷宮對該模型大鼠的學習記憶和空間探索能力等行為學及應用腦生理、病理形態學、免疫組織化學等方法對該模型大鼠發病機理進行有效性評價，證實此模型具有涉及多層面、多途徑、多靶點的整體調節作用特點，是一種符合中醫藥特色的、有效的、發病機理相對明確的并能夠適用于抗異質性及多因性老年癡呆藥物(包括中藥、天然藥物、有效部位及單體化合物)的篩選模型。
發明內容本發明的目的在于提供一種抗異質性及多因性老年癡呆藥物篩選模型的建立及應用，它是一種符合中醫藥特色的、有效的、發病機理相對明確的并能夠適用于抗異質性及多因性老年癡呆藥物(包括中藥、天然藥物、有效部位及單體化合物)的篩選模型。本發明是這樣來實現的，其特征是模型建立的方法為選取若干只大鼠，分別給予50mg/kg，d的D-gal腹腔注射，造成亞急性衰老，4W后先進行雙側頸總動脈反復結扎，造成腦缺血性病灶，用水合氯醛360mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，頸正中部常規消毒后切口，分離雙側頸總動脈，套絲線扣，拉緊絲扣，阻斷血流10min，松開絲扣使血液灌注10min后，再次阻斷血流10min，第2次再灌后觀察5min，縫合皮膚，切口局部注射慶大霉素，各組反復結扎雙側頸總動脈阻斷血流，手術完成后，將大鼠喂養3天，取未死亡的狀態良好的大鼠再腦內注射用無菌生理鹽水稀釋成5pg4U的APmo37。C孵育1W。本發明應用在該模型適用于中藥、天然藥物、有效部位及單體化合物分別對老年癡呆病人認知功能的短期維持治療的藥物篩選；延緩或預防老年癡呆疾病的藥物篩選；治療老年癡呆病人的行為問題的藥物篩選。本發明的優點是通過該模型為老年期AD、VD及混合性癡呆的發病機制和相關藥物療效研究提供一種學習、記憶功能減退老齡大鼠損傷模型，此模型可以反映老年癡呆病人真實的腦病理損傷狀態。具體實施方式1老年癡呆模型的建立1.1實驗分組將55只健康的Wistar大鼠隨機分成3組空白組、假損傷組、模型組。空白組15只，實驗組每組20只。1.2造模方法空白組不予處理。模型組分別給予D-gal(50mg/kg.d)腹腔注射，造成亞急性衰老，4W后先進行雙側頸總動脈反復結扎，造成腦缺血性病灶(大鼠水合氯醛360mg/kg腹腔注射麻醉，頸正中部常規消毒后切口，分離雙側頸總動脈，套"4"號絲線扣。拉緊絲扣，阻斷血流10min，松開絲扣使血液灌注10min后，再次阻斷血流10min，第2次再灌后觀察5min，縫合皮膚，切口局部注射慶大霉素)。實驗組反復結扎雙側頸總動脈阻斷血流。手術完成后，將大鼠喂養3天，取未死亡的狀態良好的大鼠再腦內注射凝聚態A(3L4。(A(3mo:用無菌生理鹽水稀釋成5pg4d，37"C孵育1W)。假損傷組腹腔注射生理鹽水4W，4W后先進行雙側頸總動脈反復結扎(分離頸總動脈，只穿線但不結扎)再腦內注射等量的生理鹽水。根據《大鼠腦立體定位圖譜》，確定視交叉后3mm為海馬區。操作方法如下大鼠水合氯醛360mg/kg腹腔注射麻醉，固定在腦立體定位儀上，頭部備皮，常規消毒手術區皮膚，無菌下操作，沿顱中線做長2-3cm的切口，分離骨膜，暴露出"人"字縫和"十"字縫。在前囟后3.0mm，中線右側旁開2.0mm，用7號針頭鉆開顱骨，暴露硬腦膜，微量注射器自腦表面垂直進針4.0mm，然后向腦組織內緩慢注射5plAPMo，垂直進針，注射5min，留針5min，注射后用牙科泥封堵顱骨。消炎粉消毒，縫合皮膚t"]。2老年癡呆模型評價指標的建立2.1觀察指標及取材方法2丄1大鼠行為學檢測(Morris水迷宮實驗)預先在水池里注入清水使水面高出平臺l2cm,水溫控制在24士2°C左右。水池內壁涂有黑漆，水池共分為4個象限。將平臺放在第一象限中間，在其他三個象限任選一點面向水池池壁將大鼠放入水中，試驗歷時5天，每天上午每個象限各測試一次，每次測試lmin。若大鼠在lmin之內尚未找到平臺，則將大鼠拿到平臺上并使它在上面站15s，若大鼠在lmin之內找到平臺，也讓其在平臺上站15s，方結束一次訓練，如此訓練4天。在第5天，將平臺移走，每只大鼠游lmin，記錄每只大鼠第一次經過原平臺的時間(潛伏期)，每只大鼠在lmin內經過平臺的次數、游過的總距離以及在原平臺所在象限及其它三個象限內逗留的時間，算出在第一象限游泳的時間(tO占整個游泳時間(te)的百分比。2丄2大鼠血清中生化指標的測定在2丄1大鼠行為學檢測后，每組取8只大鼠用水合氯醛(300mg/kg)麻醉后，快速開胸，行心臟采血，3500r/min離心10min取血清，置于-70。C低溫保存。按試劑盒說明書進行檢測SOD、MDA和羥自由基的含量。2丄3大鼠腦組織的病理學形態觀察和免疫組化的測定在2丄2心臟取血后，從心臟插管，先灌注生理鹽水(200ml/只)至大鼠全身無血色為止，再灌注等量的4%多聚甲醛固定液至大鼠全身僵硬，斷頭取腦。將大腦置于4%多聚甲醛液中浸泡過夜，修塊，標本選在注射部位后(標本厚0.6cm)，再置于4%多聚甲醛液中固定1~2小時，70100%乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片，處理后于光學顯微鏡下觀察病理變化。2丄3.1病理學觀察(l)HE染色光學顯微鏡下觀察腦組織細胞核呈藍黑色，胞漿呈淡紅色。(2)剛果紅染色光學顯微鏡下觀察腦組織及血管中淀粉樣物質沉積，淀粉樣物質呈深粉紅色到紅色，細胞核呈藍色。(3)神經尼氏體染色光學顯微鏡下觀察腦組織細胞中的尼氏體呈藍紫色，細胞核呈藍色。2丄3.2免疫組化染色步驟(SP法)按試劑盒說明書操作步驟進行。-陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟相同。一抗bcl-2、bax、caspase畫3、IKB陽a、(3-APP、NOS2為兔抗大鼠，ApM0為小鼠抗大鼠，COX-2為山羊抗大鼠。各一抗的稀釋比例bcl-2、bax、caspase-3、IKB-a、卩-APP為1:50;ApM0NOS2、COX畫2為1:謹。免疫組化數據統計(各指標陽性細胞數的計算)取每組大鼠腦組織切片5張，每張切片于海馬區隨機選取2個區域，在400倍顯微鏡下計算此區域內的免疫組化染色陽性細胞為棕色。由兩名人員獨立觀察，最后取平均值，結果以均數士標準差(7士s)表示，各組間數據進行t檢驗。2.2實驗結果2.2.1對大鼠空間探索能力的影響(見表2.1)表2,1大鼠空間探索能力試驗結果(7±s)組另lj例數劑量潛伏期過臺次數Vt總(n)(S)(次)(%)空白10一11.08±2.514.50±2.2432.58±4.97假損傷12一13.64±4.113.25±1.9129.78±6.02模型10一33.11±7.13'*1.75士1.05'15.98±4.21"注與空白組比較'p0.05，"pO.Ol。結果表明，空白組與假損傷組比較無顯著性差異(P>0.05)。與空白組比較，模型組大鼠潛伏期明顯延長(P<0.01)，過臺次數減少(P<0.05)，在第一象限逗留時間縮短(P<0.01)，表明模型組大鼠空間探索能力下降。2.2.2對老年癡呆大鼠血清中SOD、MDA和羥自由基含量的影響(見表2.2)表2.2大鼠血清中SOD、MDA和羥自由基的含量(7±s，n=8)組另lj劑量SODMDA羥自由基(U/ml)Cnmol/ml)(U/ml)空白一171.33±5,263.05±1.08906.63±79.26假損傷一168.92±5.863.34±1.07853.39±67.10模型一141.0肚7.77"10.63±3.32"547.82±113.78**注與空白組比較"pO.Ol。結果表明，空白組與假損傷組比較無顯著性差異(P>0.05)。與空白組比較，模型組大鼠血清SOD活力明顯降低(P<0.01)，MDA含量升高(P<0.01)，抑制羥自由基能力降低(P<0.01)。2.2.3對老年癡呆大鼠腦組織病理學形態觀察和免疫組化的測定2.2.3.1對AD大鼠腦組織病理學形態觀察結果HE染色的一般形態學觀察光鏡下，空白組和假手術組大鼠海馬區錐體細胞排列為24層，結構緊密，排列整齊，細胞個體大，細胞核清晰；皮質區神經細胞數量較多，膠質細胞散布于神經細胞之間，有小血管分布。模型組海馬區細胞排列稀疏、雜亂、胞漿深染、有的細胞核固縮、細胞線不清晰，神經膠質細胞明顯增多；皮質區神經細胞減少和膠質細胞增多，多散在分布。剛果紅染色的一般形態學觀察光鏡下，空白對照組和假手術組大鼠腦組織神經細胞及血管臂剛果紅染色陰性。模型組腦組織內有淀粉樣物質沉著，染色陽性，血管壁剛果紅染色呈陽性。尼氏體甲苯胺藍染色的一般形態學觀察光鏡下，空白對照組和假手術組大鼠海馬區錐體細胞結構緊密，排列整齊，層次豐富，尼氏小體豐富清晰。模型組海馬區細胞排列稀疏、雜亂，尼氏小體著色淡。2.2.3.2對AD大鼠腦組織免疫組化觀察結果j3-APP免疫反應免疫反應物位于胞質、細胞膜及突起，呈棕褐色。空白對照組和假手術組皮質神經元和海馬神經元胞質少量陽性表達。模型組皮質及海馬區神經元細胞胞質有大量的陽性表達，呈棕黃色細顆粒為戒指環狀、梭形和錐體形。模型組與空白組比較差異顯著(PO.Ol)，結果見表2.3。APw。免疫反應AP免疫反應陽性產物位于細胞膜及細胞間質，呈棕褐色。Aj3在針道周圍見大量的棕褐色(3淀粉樣蛋白沉積，海馬損傷區有顯著的Ap陽性物質沉積。空白對照組和假手術組皮質和海馬區可見部分細胞出現抗AP抗體陽性反應，著色淺淡。模型組皮質及海馬區廣泛分布A(3陽性細胞，胞質和胞膜著色，突起處著色較深，呈卵圓形、三角形或不規則形。模型組與空白組比較差異顯著(PO.Ol)，結果見表2.3。COX-2免疫反應COX-2免疫反應陽性產物位于細胞膜和細胞質，呈棕褐色。空白對照組和假手術組皮質神經元和海馬神經元胞質少量陽性表達。模型組皮質及海馬區神經元細胞胞質有大量的陽性表達。模型組與空白組比較差異顯著(PO.Ol)，結果見表2.4。IKB-a免疫反應IKB-(x免疫反應陽性產物在神經元細胞及膠質細胞胞漿內顯色明顯，呈淡棕色。空白對照組和假手術組皮質神經元和海馬神經元胞質少量陽性表達。模型組皮質及海馬區神經元細胞胞質有大量的陽性表達，海馬區細胞固縮較明顯。模型組與空白組比較差異顯著(PO.Ol)，結果見表2.4。NOS2免疫反應NOS2免疫反應陽性產物在神經元細胞漿、突起著色，陽性細胞顯色為棕黃色微細顆粒狀。空白對照組和假手術組皮質神經元和海馬神經元胞漿少量陽性表達。模型組皮質及海馬區神經元細胞顯示NOS2過表達，反應顏色明顯加深，皮層富含星形角質細胞。模型組與空白組比較差異顯著(PO.Ol)，結果見表2.5。Caspase3免疫反應Caspase3蛋白主要在神經元胞膜、胞漿和突起中表達，部分神經元胞核著色，陽性細胞呈棕色或棕黃色，顯示棕黃色為強陽性，淡黃色為弱陽性。空白對照組和假手術組皮質神經元和海馬神經元有少量的弱陽性表達細胞。模型組皮質及海馬區神經元呈強陽性表達，海馬區細胞有核固縮現象。模型組與空白組比較差異顯著(PO.Ol)，結果見表2.5。表2.3AD大鼠腦組織p-APP、AP,.柳陽性神經元的數量(7±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注與空白組比較"pO.Ol。表2.4AD大鼠腦組織COX-2、IKB-a陽性神經元的數量(7±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注與空白組比較"pO.Ol。表2.5AD大鼠腦組織NOS2、Caspase3陽性神經元的數量(x±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注與空白組比較"pO.Ol。3老年癡呆模型有效性評價結果的分析3.1對AD大鼠血清中SOD、MDA和羥自由基三個生化指標的分析氧化應激(Oxidativestress)是指機體活性氧的產生過多及機體抗氧化能力下降，活性氧的清除不足，導致活性氧在體內增多并引起細胞氧化損傷的病理過程。本實驗通過檢測SOD、MDA和羥基自由基來了解機體受氧自由基的損傷及機體清除氧自由基的作用強弱。實驗結果顯示，空白組與假損傷組比較無顯著性差異(P〉0.05)。與空白組比較，模型組大鼠血清SOD活力明顯降低(P<0.01)，MDA含量升高(P<0.01)，抑制羥自由基能力降低(P<0.01)，說明此模型與氧化應激具有相關性。3.2對AD大鼠腦組織病理學和免疫組化的結果分析3.2.1病理學的結果分析采用HE染色、剛果紅染色和尼氏體甲苯胺藍染色對大鼠海馬區和皮質區的神經元細胞進行觀察和比較。結果發現光鏡下，空白對照組和假手術組大鼠海馬區錐體細胞排列為24層，結構緊密，排列整齊，細胞個體大，細胞核清晰；皮質區神經細胞數量較多，膠質細胞散布于神經細胞之間，有小血管分布。HE染色正常，神經細胞及血管臂剛果紅染色陰性，尼氏小體豐富清晰。模型組海馬區細胞排列稀疏、雜亂、胞漿深染、有的細胞核固縮、細胞線不清晰，神經膠質細胞明顯增多；皮質區神經細胞減少和膠質細胞增多，多散在分布。腦組織內有淀粉樣物質沉著，剛果紅染色陽性，血管壁剛果紅染色呈陽性，尼氏小體著色淡。以上結論說明造模成功。3.2.2免疫組化的結果分析(3-APP免疫反應:模型組皮質及海馬區神經元細胞胞質有大量的陽性表達，呈棕黃色細顆粒為戒指環狀、梭形和錐體形。具有統計學意義(PO.Ol)，說明此模型具有AD的病理級聯反應特征和造模成功。ApMo免疫反應模型組皮質及海馬區廣泛分布AP陽性細胞，胞質和胞膜著色，且突起處著色較深，呈卵圓形、三角形或不規則形。具有統計學意義(PO.01)，說明此模型具有AD的病理特征和造模成功。NOS2免疫反應模型組皮質及海馬區神經元細胞顯示NOS2過表達，反應顏色明顯加深，皮層富含星形角質細胞。具有統計學意義(PO.Ol)，說明NOS2參與并促進AD病理變化進行性發展。COX-2免疫反應模型組皮質及海馬區神經元細胞胞質有大量的陽性表達。具有統計學意義(PO.Ol)，說明此模型與血管危險因子(心臟病、中風、高血壓、低血壓、動脈粥樣硬化和短暫性腦缺血發作等)有關。IKB-a免疫反應模型組皮質及海馬區神經元細胞胞質有大量的陽性表達，而且海馬區細胞固縮較明顯。具有統計學意義(PO.Ol)，說明此模型與炎癥反應有關。Caspase-3:Caspase(半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶)是特異的凋亡信號轉導分子，激活后的Caspase是凋亡執行者，因此有人稱之為"細胞凋亡的效應器"。3.2.3幾種免疫組化指標的相關性分析老年斑中主要含有大量不可溶的Ap，也是一個局部的非免疫介導的慢性炎性反應。小膠質細胞和星形細胞均可被纖維性或可溶性A卩激活，激活的小膠質細胞可以分泌多種細胞因子和蛋白，并增加NOS表達而釋放NO，導致神經細胞損傷。小膠質細胞的活化也促進了APOE的表達，而APOE對Aj3的異常沉積是必需的。COX-2的表達可以增強淀粉樣斑塊的形成，而且與A卩水平升高相一致，但APP的表達和含量沒有改變，說明COX-2還可以通過影響APP的代謝過程，推動淀粉樣變性病的產生[4]。轉錄因子NF-kB是介導許多免疫和炎癥反應的中心物質，同時也是細胞凋亡信號通路中一個重要的轉錄調節因子。NF-kB的激活與AP的沉積相關，有研究發現A卩可以激活體外培養神經元中的NF-kB[5]。同時A(3誘導iNOS表達和NO的釋放是通過依賴NF-kB激活的機制來實現的，而NO是氧化應激中重要的自由基問。自由基能促進A卩沉積，沉積后使其毒性增加，從而進一步損傷神經元，引起神經元退行性變。進一步的研究還發現，NF-kB活性的升高與AD患者上顳葉回中COX-2的轉錄呈高度相關。AP與細胞凋亡關系密切，AP引起神經細胞凋亡一方面可能通過Caspase起作用。其中，Caspase-3與APP剪切關系最緊密，而APP的堆積可激活Caspase-3。目前認為Caspase-3引起凋亡的機制可能是裂解APP，產生碳氧段斷裂的片段，這個片段有細胞毒作用，其毒性作用依賴其內含的ApL2。區段最終引起細胞凋亡。另一方面，Ap對凋亡基因的表達也有影響，Bcl-2蛋白家族在細胞內凋亡信號轉導中起關鍵作用[7]。由此可見，以上各種指標是相互引發、共同作用于機體產生一定的多層面、多途徑、多靶點的病理機理。主要通過曾加(3-APP和APwo的陽性細胞表達；能夠曾加iNOS過表達，激活COX-2和核因子NF-kB的活性來促進AD大鼠的腦損傷過程；能夠使Caspase-3活化，并減少Bcl-2的表達量，增加Bax的表達，從而促使細胞凋亡。我們可以認為，抗異質性及多因性老年癡呆藥物篩選模型的作用機理是多途徑、多角度、多方面共同發揮療效的。權利要求1、一種抗異質性及多因性老年癡呆藥物篩選模型的建立，其特征是模型建立的方法為選取若干只大鼠，分別給予50mg/kg·d的D-gal腹腔注射，造成亞急性衰老，4W后先進行雙側頸總動脈反復結扎，造成腦缺血性病灶，用水合氯醛360mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，頸正中部常規消毒后切口，分離雙側頸總動脈，套絲線扣，拉緊絲扣，阻斷血流10min，松開絲扣使血液灌注10min后，再次阻斷血流10min，第2次再灌后觀察5min，縫合皮膚，切口局部注射慶大霉素，各組反復結扎雙側頸總動脈阻斷血流，手術完成后，將大鼠喂養3天，取未死亡的狀態良好的大鼠再腦內注射用無菌生理鹽水稀釋成5μg/μl的Aβ1-4037℃孵育1W。2、一種權利要求1所述的抗異質性及多因性老年癡呆藥物篩選模型的應用，其特征是適用于中藥、天然藥物、有效部位及單體化合物分別對老年癡呆病人認知功能的短期維持治療的藥物篩選、延緩或預防老年癡呆疾病的藥物篩選、治療老年癡呆病人的行為問題的藥物篩選。全文摘要一種抗異質性及多因性老年癡呆藥物篩選模型的建立，其特征是取衰老大鼠各組反復結扎雙側頸總動脈阻斷血流，手術完成后，將大鼠喂養3天，取未死亡的狀態良好的大鼠再腦內注射用無菌生理鹽水稀釋成5μg/μl的Aβ_1-40(37℃孵育1W)。本發明的優點是通過該模型為老年期AD、VD及混合性癡呆的發病機制和相關藥物療效研究提供一種學習、記憶功能減退老齡大鼠損傷模型，此模型可以反映老年癡呆病人真實的腦病理損傷狀態。文檔編號A61K31/7004GK101601677SQ200910115640公開日2009年12月16日申請日期2009年7月3日優先權日2009年7月3日發明者匡海學,左月明,張忠立申請人:江西中醫學院