專利名稱：具有抗腫瘤活性的金鐵鎖總皂苷及其制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種金鐵鎖有效部位一總皂苷在抗腫瘤作用方面的應用及其制劑。
背景技術：
惡性腫瘤一直是嚴重威脅人類健康的重大疾病之一。抗腫瘤藥物的藥物毒性及不良反應也越來越受到重視。世界各國科研人員一直在為尋找具備一定選擇性抗腫瘤的候選藥物而不懈努力。尋求毒副作用小、抗腫瘤作用強，具有一定選擇性抗腫瘤的藥物是目前和將來的研究熱點和重點。天然藥物是理想的抗腫瘤候選藥物篩選的一大寶庫，如紫杉醇、喜樹堿等一批具有較強抗腫瘤活性的天然藥物被篩選出來，表現出了較好的臨床療效和應用前景。因此，鑒于我國自然草藥資源豐富，民族、民間草藥用藥經驗廣泛的特點，從民族民間用藥中篩選出毒副作用小、抗腫瘤作用強的藥物及其有效部位，具有相當的優勢。在從民族民間藥物中篩選抗腫瘤活性的候選藥物的過程中，首次發現了苗族藥物金鐵鎖具有很強的抑制腫瘤細胞和實體瘤生長的作用，而對正常細胞和小鼠體重等方面的影響明顯，這是一個令人興奮的重要發現。金鐵鎖PsammosiIenetunicoides W. C. Wu et C. Y. Wu 為石竹科單屬種植物，別名獨定子、蜈蚣七、對葉七、白馬分鬃等，主要分布于貴州、云南、四川、西藏等中國西南地區， 是苗族民間常用藥物之一。其功效具有散淤定痛，止血，消癰排膿等作用。主治跌打損傷， 風濕，胃痛，癰疽瘡癤，創傷出血等。主要化學成分含有三萜、三萜皂苷、環肽以及內酰胺以及氨基酸和有機酸等，藥理作用主要集中在鎮痛、抗炎、免疫和抗類風濕等幾個方面。在本發明之前，尚未見有金鐵鎖抗腫瘤作用及臨床運用方面的報道。

發明內容
本發明的目的之一是提供金鐵鎖具有抗腫瘤作用有效部位-總皂苷及制備方法；本發明的目的之二是提供金鐵鎖總皂苷藥物制劑的制備方法；本發明的目的之三是提供金鐵鎖的抗腫瘤作用的新用途及實驗數據；本發明通過以下技術方案來實現本發明金鐵鎖總皂苷的制備方法取金鐵鎖藥材粉碎后，經乙醇70°C _95°C回流提取1-3次，每次1-3小時，合并提取液，減壓回收乙醇得浸膏。取浸膏以2倍量的水溶解后， 以正丁醇萃取3次，合并正丁醇層，減壓蒸干溶劑后得金鐵鎖總皂苷粗提物；然后將金鐵鎖總皂苷粗提物用低碳醇溶解，過大孔吸附樹脂柱，以梯度乙醇-水溶液為流動相進行洗脫，再用TLC方法監測流出產物，收集含金鐵鎖總皂苷的流出產物；合并洗脫液，減壓濃縮去除溶劑，冷凍或噴霧干燥至粉，得金鐵鎖總皂苷。本發明的藥物制劑含有-99%的金鐵鎖總皂苷和99% -1%的賦形劑，優選含有20% -80%的賦形劑，最好含有40% -60%的金鐵鎖總皂苷和60% -40%的賦形劑。按照藥劑學制備工藝和方法，可以將本發明的金鐵鎖總皂苷制備成多種抗腫瘤藥物的臨床應用劑型，包括口服制劑和非腸道給藥劑型。所指的口服機制包括片劑、膠囊劑、脂質體、滴丸、緩控釋劑、微孔滲透、薄膜包衣、乳劑、顆粒劑、口崩片中的任何一種；非腸道給藥劑型包括注射劑、粉針劑中的任何一種。本發明通過體外腫瘤細胞培養實驗，初篩金鐵鎖總皂苷的抗腫瘤作用的藥理學活性并評價其作用效價，然后通過整體動物實驗進一步驗證其抗腫瘤作用及強度。體外細胞實驗篩選了金鐵鎖總皂苷對胃癌、肝癌、結腸癌、卵巢癌、乳腺癌共5種腫瘤細胞抑制作用及其效價，同時比較的研究其對正常脾淋巴細胞抑制作用情況，考察了金鐵鎖總皂苷其對腫瘤細胞株殺傷作用的選擇性和敏感性，分析了其對腫瘤細胞的特異性抑制作用，以及對正常細胞生長有無明顯影響。通過整體動物實驗，分析了金鐵鎖總皂苷對S18tl小鼠實體瘤生長的抑制作用以及對小鼠體重的影響。


圖1是金鐵鎖總皂苷(TSPT)及各給藥組小鼠S18tl瘤體大小的比較中“生理鹽水”是指生理鹽水給藥組；“TSPT大劑量”、“TSPT中劑量”、“TSPT小劑量” 分別是指金鐵鎖總皂苷分別為10mg/kg、5mg/kg、2. 5mg/kg的給藥劑量組；“順鉬”是指陽性對照藥順鉬給藥組。具體實施例如下實施例1金鐵鎖總皂苷的制備方法優化后的提取條件是取金鐵鎖藥材3kg，以8倍量體積為95%的乙醇76°C條件下回流提取3次，每次lh，合并提取液，減壓回收乙醇至干，然后將金鐵鎖提取物用低碳醇溶解，過大孔吸附樹脂柱，分別以10 %，30 %，50 %，70 %，90 %乙醇-水溶液為流動相進行洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮去除溶劑，冷凍或噴霧干燥至粉，得金鐵鎖總皂苷151. 3g。實施例2金鐵鎖總皂苷對體外5種腫瘤細胞的抑制作用細胞乳腺癌細胞(MCF-7)、人結腸癌細胞C26、人肝癌細胞BEL-7401、人卵巢癌細胞(SK0V3)、人胃癌細胞(BGC-823)，上述5種腫瘤細胞均由中國醫學科學院腫瘤醫院提供。藥品與試劑金鐵鎖總皂苷，由北京中醫藥大學分子生藥實驗室提供，白色粉末，青霉素(Sigma, USA)、鏈霉素(Sigma, USA)；胰蛋白酶(Sigma, USA)、RPMI1640 培養基(Gibco, Invitragen co.，USA)；胎牛血清(Gibco, Invitragen co.，USA) ；二甲基亞砜(DMSO) (Sigma, USA)、四甲基偶氮唑藍(MTT) (Sigma, USA)。培養條件溫度37°C、濕度 100%、含5%二氧化碳空氣中培養。儀器:C02培養箱(Thermo 311型)；超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；倒置熒光顯微鏡(BDS200型)；酶標自動分析儀(華東電子集團醫療裝備有限公司)；臺式離心機 (Anke7DL-50B型)；高壓滅菌鍋(日本森展企業有限公司)；冰箱(Hisense 225U型)；電熱恒溫干燥箱(中興202型)實驗方法，MTT法各種腫瘤細胞株按照常規方法培養傳代，收集對數生長期的細胞，調節細胞懸液濃度；取96孔細胞培養板，每孔加入細胞懸液180 μ L (3000個/孔)， 于37°C，5% CO2培養箱中培養池。金鐵鎖總皂苷溶解在生理鹽水中，終濃度為4 μ g/mL、 16 μ g/mL,64 μ g/mL,256 μ g/mL、512 · μ g/mL,各 20 μ L/ 孔，每濃度 8 個復孔，正常對照組加入等量1640培養基，同時設順鉬陽性對照20μ L，終濃度為312μ g/mL，于37°C，5% CO2 培養箱中培養48h。棄去培養液，每孔加入200 μ L MTT溶液(原液5mg/mL)，繼續培養4h。 棄去MTT，每孔加入200 μ L 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD 540nm處測量各孔的吸光值。計算抑制率和IC5tl值。實驗結果顯示(見表1)，金鐵鎖皂苷1. 6 μ g/mL對部分腫瘤細胞株如人胃癌細胞 (BGC-823)、和乳腺癌細胞(MCF-7)的增殖沒有明顯的抑制作用，但隨著藥物劑量的增加至 6. 4 μ g/mL、25. 6 μ g/mL、52. 1 μ g/mL時，對各腫瘤細胞株均呈現明顯的生長抑制作用，并具有一定的濃度依賴關系，最高抑制率達71. 4% (人胃癌細胞株BGC-82;3)和71. 9% (人結腸癌細胞C26)。數據還顯示，人結腸癌細胞以6對金鐵鎖總皂苷最為敏感，IC50值最小僅為9. 02 μ g/mL，說明金鐵鎖總皂苷抗癌作用效價較強，作用強度接近臨床常用化療西藥如順鉬等。表1金鐵鎖總皂苷對5種腫瘤細胞的抑制率及IC5tl值
P制率(%)
金鐵鎖總皂苷(Me/niL)
IC50
細胞株1.66.425.651.2BGC-8230.067.071.471.019.,85Bel-740113.039.854.155.423.,79SK0V315.955.457.158.815.,64MCF-70.058.763.258.323.,26C2624.250.871.963.59.02實施例3金鐵鎖總皂苷對正常脾細胞的作用脾細胞免疫細胞培養6 8周齡昆明小鼠，頸椎脫臼處死，75 %乙醇浸泡3min，取出小鼠置于無菌紙上， 左腹側朝上；在小鼠左腹側中部剪開小口，撕開皮膚，暴露腹壁，可見紅色長條狀脾臟；在脾臟下側提起腹膜，剪開后上翻，暴露脾臟，用鑷子提起脾臟，眼科剪分離脾臟下面的結締組織，取出脾臟。放入盛有5mL Hanks液的培養皿中；將脾臟放置不銹鋼網QOO目)上， 用注射器針芯輕輕研壓脾臟，獲細胞懸液。培養液10%小牛血清、青霉素lOOu/mL、鏈霉素 100u/mL的RPMI 1640。培養條件溫度37°C、濕度100%、含5%二氧化碳空氣中培養。細胞增殖檢測取96孔細胞培養板，每孔加入細胞懸液10(^1^，濃度3\105個/1^，371，5% CO2 培養箱中培養濁。終濃度為 32μ g/mL、6. 4μ g/mL、8. Ομ g/mL、12. 8μ g/mL、25. 6g/mL，各 10 μ L/孔，每濃度8個復孔，正常對照組只加入等量的溶媒(30%乙醇-NaCl溶液)，同時設 ConA陽性對照組ConA 10 μ L，終濃度為5 μ g/mL,于37°C ,5%C02培養箱中培養48h。取出細胞培養板，倒置顯微鏡下觀察細胞形態。每孔加入20 μ L MTT溶液(原液5mg/mL)，繼續培養4h。棄去培養液，用PBS沖2-3遍(根據細胞貼壁情況確定是否沖洗)，每孔加入100 μ L 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD 540nm處測量各孔的吸光值。增殖率=(處理組OD值一對照組OD值)/對照組OD值X 100%實驗結果顯示(見表2)，金鐵鎖總皂苷在6. 4 μ g/mL時開始出現對脾淋巴細胞的輕微抑制作用，但這種作用較小，當劑量高達51. 2 μ g/mL時，其抑制率僅為2. 1%，與相同劑量對腫瘤細胞的抑制率71. 0%相比(參見表1)，金鐵鎖總皂苷對正常細胞的這種抑制作用顯得微不足道。由實施例2和實施例3可知，金鐵鎖總皂苷對腫瘤細胞具有選擇性細胞毒作用，而對正常細胞的細胞毒性相對較小。表2金鐵鎖總皂苷對脾細胞的增殖抑制作用
權利要求
1.苗藥金鐵鎖抗腫瘤活性有效部位，其特征在于其有效部位提取物為總皂苷，其基本母核結構為齊墩果烷型五環三萜類化合物，該提取物中金鐵鎖總皂苷含量在50%以上。
2.根據權利要求1所述的金鐵鎖總皂苷，其特征在于所提取溶劑為乙醇、水及其不同的配比。
3.根據權利要求1所述的金鐵鎖總皂苷，所述提取方法為回流提取，提取溫度為 70-100°C，至少提取一次，每次時間為40分鐘-1小時。
4.一種用于腫瘤治療的藥物制劑，其特征在于含有抗腫瘤作用的有效劑量的金鐵鎖總皂苷和一種或多種藥學上可以接受的賦形劑，或可以與金鐵鎖總皂苷租方的其它藥物。
5.根據權利要求4所述的制劑，其特征在于含有-99%的金鐵鎖總皂苷和 99% -1%的藥用賦形劑或其它可組方的藥物。
6.根據權利要求4所述的藥物制劑，其特征在于所說的藥物制劑是指非腸道給藥或口服類制劑。
7.根據權利要求4所述的藥物制劑，其特征在于所說的口服制劑選自于片劑、膠囊劑、 脂質體、滴丸、緩控釋劑、微孔滲透泵、薄膜包衣、乳劑、顆粒劑、口崩片的任何一種；非腸道給藥的劑型選自于注射劑、粉針劑當中的任何一種。
8.金鐵鎖總皂苷在制備抗腫瘤藥物中的應用。
9.根據權利要求8的用途，其特征在于所說的抗腫瘤活性是指抑制腫瘤細胞的增殖和抑制實體瘤的生長。
10.根據權利要求9的用途，其特征在所說的腫瘤細胞包括5種乳腺癌細胞(MCF-7)、 人結腸癌細胞C26、人肝癌細胞BEL-7401、人卵巢癌細胞(SK0V3)、人胃癌細胞<(BGC-823)； 所說的實體瘤為S180的小鼠移植性腫瘤。
全文摘要
本發明公開了一種苗族藥物金鐵鎖抗腫瘤作用的新用途，同時公開了其抗腫瘤活性藥用部位的制備方法及其制劑。制備方法主要經過乙醇提取，濃縮，正丁醇萃取、大孔吸附樹脂純化等步驟獲得金鐵鎖總皂苷。以總皂苷為原料，制備成片劑、膠囊劑、注射劑等臨床常用的藥物制劑。藥效學評價采用體內外結合的方法。體外試驗顯示，TSPT對胃癌、肝癌、結腸癌、卵巢癌、乳腺癌、黑色素瘤，6種腫瘤細胞具有較強的抑制作用，而對正常脾淋巴細胞抑制不明顯；整體動物體內實驗結果顯示，該藥對S180實體瘤抑制率高達72％，作用效價高，而對小鼠體重影響不大；與陽性藥順鉑比，副作用較低。上述實驗結果表明，該藥抗癌效價強、副作用低，具備原始創新的優勢。
文檔編號A61P35/00GK102232988SQ20111016384
公開日2011年11月9日 申請日期2011年6月17日 優先權日2011年6月17日
發明者劉春生, 張元 , 張園園, 王學勇, 王秀麗, 趙保勝, 高偉 申請人:王學勇