專利名稱：腫瘤疫苗的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種生物制品的制備方法，特別是細胞水平腫瘤疫苗的制備。
近年來人們已將腫瘤疫苗的開發研究列入四大抗癌生物工程產品之一。采用各種方法和技術(包括化學和生化方法、單克隆抗體以至基因工程技術等)，從腫瘤細胞提取或克隆表達出高純度的TAA(見李春海、孫志賢主編的《腫瘤標志研究進展》刊物中樊代明的文章〈腫瘤疫苗的研究進展〉34-39，1992)這要求有較高的技術和設備條件，費時、費錢，不僅難以推廣應用，而且這種高純度TAA產品的主動免疫抗癌療效尚有待臨床驗證。最近有資料(如在MG.Hannaetal.In“PrinciplesofCancerBiotherapy”，RKOldham(ed).2ndEdpp253～283MarcelDekkerInc.NewYork，1991)介紹，目前國外臨床應用的瘤苗就是分別用放射能(X-線、鈷60等)或抗癌藥(如絲裂霉素C，即MMC)或病毒(痘苗病毒)處理的，雖已取得一定療效，但其不足之處在于單因素處理療效有限;而且都是采用新鮮或液氮凍存的腫瘤細胞，滅能，要求有專門設備(如放射能)或不易控制(如MMC、病毒)或現用現做，耗能費時，既不方便更難保存。
鑒于上述現有技術中的不足之處本發明的目的在于提供一種療效高、滅能徹底、使用安全、保存方便、簡單易行的腫瘤疫苗的制備方法。
本發明的目的可通過以下措施來實現一種腫瘤疫苗的制備方法，首先要制備單個瘤細胞懸液，即將腫瘤組織制成1mm3的小塊，洗滌后依次用胰酶(0.14%)、DNA酶(0.03%)消化，置4℃8～16小時，再經搖床震蕩30分鐘，然后用200目不銹鋼網過濾，濾液被離心洗滌之后用氯化銨緩沖液處理，可得到單個瘤細胞懸液，其特征在于細胞水平瘤苗的制備如下
Ⅰ型瘤苗將上述單個瘤細胞懸液與等體積的200～400μg/ml的莪術油或100～200μg/ml的β欖香烯及終濃度為50～100μg/ml的MMC處理60～120分鐘，離心洗滌后加入醛類固定劑，再與短小棒狀桿菌(CP)混合成為混合瘤苗;或Ⅱ型瘤苗向上述單個瘤細胞懸液加入新城雞瘟病毒(NDV)按100-1000血凝單位(HU)/3×106-7瘤細胞或者用紫外線滅能的痘苗病毒(UV-VV)按感染倍數(Moi)為10的比例處理，于37℃、5%CO2下溫育4小時，離心洗滌后再分別與等體積的200～400μg/ml莪術油或100～200μg/mlβ-欖香烯混合，再于37℃溫育30～60分鐘，離心后向細胞沉淀加入醛類固定劑并與CP混合，或Ⅲ型瘤苗向上述單個瘤細胞懸液加入新城雞瘟病毒(NDV)按100～1000血凝單位(HU)/3×106-7瘤細胞或者用紫外線滅能的痘苗病毒(UV-VV)按感染倍數(Moi)為10的比例處理，于37℃、5%CO2下溫育4小時，離心洗滌后再分別與等體積的200～400μg/ml莪術油+MMC或100～200μg/mlβ-欖香烯+MMC混合，再于37溫育30～60分鐘，離心后向細胞沉淀加入醛類固定劑并與CP混合。最好醛類固定劑為0.0125%的戊二醛。
本發明的方法主要是采用抗癌中藥莪術及其有效成分β欖香烯直接處理腫瘤細胞制備細胞水平的瘤苗;經過多因素綜合處理后用醛類固定劑固定;并與佐劑短小棒狀桿菌(CorynebacteriumParvum即CP混合制成混合瘤苗。
一、本發明細胞水平瘤苗的制備方法1.首先制備單個瘤細胞懸液將在無菌條件下手術切除的各種實體瘤患者的新鮮腫瘤標本(包括原發瘤及/或轉移瘤)于取材供病理組織學檢(復)查后，按常規方法除去包膜、結締組織及出血壞死腫瘤組織，選取新鮮腫瘤組織剪成1mm3大小碎塊，洗滌數次，依次用胰酶(0.14%)、DNA酶(0.03%)消化，置4℃處理8～16小時，如為膠原含量較多的瘤塊則改用0.14%的膠原酶Ⅳ(即COⅡagenaseⅣ)消化。然后將經酶消化的瘤組織用搖床震蕩30分鐘，之后用200目不銹鋼網過濾，將濾液離心洗滌，再用155mM的氯化銨緩沖溶液去除其中的紅細胞再混懸即成為單個瘤細胞懸液，如系癌性胸腹水則不必經過酶消化過程，即可直接制備成濃度為3×107～3×108個/ml單個瘤細胞懸液。
2.細胞水平瘤苗的制備它是以抗癌中藥莪術油(OleumCurcumaaromatica縮寫為OCA)及其有效成分β-欖香烯(βelemene)為主，結合化療藥物如絲裂毒素C(MMC)及/或病毒如痘苗病毒(VacciniaVirus，簡寫為VV)或新城雞瘟病毒(Newcastlediseasevirus，簡寫為NDV)進行復合處理，并用醛類如戊二醛、多聚甲醛、甲醛滅能固定，即可制備出三種復合處理的細胞水平瘤苗，如下表所示。
表1是經復合方法處理制備的瘤苗類型。
瘤苗類型復合處理方法Iβ-欖香烯(或OCA)+MMCII病毒(VV或NDV)+β-欖香烯(或OCA)III病毒(VV或NDV)+β-欖香烯(或OCA)+MMC其中Ⅰ型瘤苗經醛類固定劑滅能固定，并與短小棒狀桿菌菌苗(CP死菌苗)混合成混合瘤苗供臨床主動免疫治療之用。余下Ⅱ、Ⅲ型瘤苗均先經過病毒處理，然后再用β-欖香烯或β-欖香烯-MMC處理，最后用醛類固定劑滅能固定，加入CP混合備用。
上表中細胞水平瘤苗的制備工藝過程分兩種第一種是不采用病毒處理的工藝如Ⅰ型瘤苗，第二種是先用病毒處理后再用與前述的第一種方法相同的方式處理。其中不采用病毒處理的工藝即直接用藥物(中藥和西藥)處理腫瘤細胞，具體方法是所用的中藥有莪術油2%乳劑，或β-欖香烯2%乳劑或β-欖香烯0.2%注射液，先分別用生理鹽水稀釋，其中莪術油的濃度為200～400μg/ml，β-欖香烯的濃度為100～200μg/ml。然后將它們與等體積的腫瘤細胞懸液混合，于37℃溫育30～60分鐘，(當用臺盼蘭排除法測定所處理的腫瘤細胞蘭染率達50%左右時)加入西藥MMC，使MMC的終濃度為50～100μg/ml，繼續處理30～60分鐘離心洗滌，然后再加入醛類固定劑如0.0125%的戊二醛或2%的多聚甲醛或10%福爾馬林(甲醛)固定液，用這種中西藥復合因素處理的瘤苗較用單種藥物處理的瘤苗免疫原性強。而且用醛類固定劑固定的瘤苗即可達到滅能、滅菌、防毒(病毒)和長期保存(不必低溫凍存)的目的，其安全性及有效性也早已在有關生物制品的免疫學理論和防治實踐中獲得證明。該Ⅰ型瘤苗在制成后立即(或于臨用前)與CP混合成終濃度為3×106～7個瘤細胞/0.5mgCP/ml的混合瘤苗，可使非特異性與特異性主動免疫結合起來，從而進一步提高瘤苗的免疫抗癌效應。制備細胞水平瘤苗的第二種工藝方法是先將腫瘤細胞懸液用病毒處理，其可以是紫外線滅能的痘苗病毒(UV-VV)按感染倍數(Moi)為10的比例，也可以是新城雞瘟病毒(NDV)按100～1000血凝單位(HU)/3×106～7瘤細胞的比例，于37℃、5%CO2下溫育4小時，洗滌后再分別與β欖香烯(或莪術油)(Ⅱ型)或β-欖香烯(或莪術油)+MMC(Ⅲ型)混合，其藥物濃度、處理條件及滅能固定、混合CP均與Ⅰ型瘤苗的制備方法相同。
本發明的方法具有如下優點1.方法簡單、可靠制備細胞水平腫瘤疫苗比分離提純TAA要簡便、實用、可靠得多。
2.中草藥瘤苗為新的抗癌生物學制劑以抗癌中藥莪術及其有效成分β-欖香烯制備瘤苗在國內外均屬首創。這類以莪術油或β-欖香烯為主要成分的瘤苗比國外通常用放射能(X線、鈷60)照射制備瘤苗的主動免疫效果好，且易于普及推廣。
3.可長期保存本發明的瘤苗在一般條件下可有效地長期保存，這就為自體瘤苗、異體瘤苗的應用以至“瘤苗庫”設想的實現創造了條件。
4.使用安全本發明所制備的瘤苗是絕對滅能、滅菌(包括病毒、支原體)無毒的，使用十分安全，而且副作用也輕(局部、全身反應都輕)易于為患者和臨床醫護人員接受。
5.免疫效能增強采用中藥(莪術油及β-欖香烯)化療藥(MMC)及/或病毒(VV或NDV)復合處理并與CP混合應用，使瘤苗的免疫原性增強。因此本發明瘤苗的使用作為一種輔助療法將會產生予期的療效，特別是對于術后控制微小殘余瘤、防止轉移與復發爭取治愈更為理想，即使是對某些晚期腫瘤(包括轉移腫瘤)患者也會有一定的療效-延長生命、減少復發、控制轉移、或提高生活質量等。
例1在無菌及0～4℃條件下將手術切除的結腸癌塊(包括原發瘤及/或轉移瘤)去除包膜、結締組織、出血壞死組織后，剪成1mm3大小的碎塊，置50ml離心管中用適量磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌之后，以1000轉/分的速度離心8分鐘棄除上清液。向沉淀細胞中加入含0.14%胰酶，0.02%EDTA的Hanks緩沖鹽溶液(HBSS)30毫升置4℃冰箱過液。翌日取出置37℃水浴中搖床震蕩30分鐘，之后用200目不銹鋼網過濾，將濾液以1000轉/分離心8分鐘，再向沉積的細胞中加入0.03%DNA酶15ml，于37℃水浴搖床震蕩30分鐘后，以1000轉/分離心8分鐘，之后向沉淀細胞中加入155mM氯化銨緩沖液10ml，于室溫下作用10分鐘再加入磷酸鹽緩沖液(PBS)30ml，然后再以1000轉/分離心8分鐘，之后加入磷酸鹽(PBS)10ml計數腫瘤細胞數量，用臺盼蘭拒染法測活瘤細胞百分率大于70%。取上述10ml瘤細胞懸液加入100～200μg/ml的β欖香烯10ml和終濃度為100μg/ml的MMC于37℃溫育30～60分鐘，然后以1000轉/分離心8分鐘洗滌2次，向細胞沉淀加入0.0125%之戊二醛，再加入短小棒狀桿菌(CP)0.5mg/ml調整細胞數為1×107個/ml即可得到Ⅰ型混合瘤苗。將這些Ⅰ型混合瘤苗封裝于2ml的安瓿中1ml/支，(此前檢查瘤苗細胞形態、完整性并取材檢菌)，最后置于4℃冰箱中避光保存。該制備過程所得的外觀為無色半透明混懸液即為結腸癌Ⅰ型混合瘤苗。
例2重復實施例1中制備單個細胞懸液的操作，用RPMI1640培養液(含常規量慶大霉素、HEPES、NaHCO3、PH＝7.2～7.4)調整腫瘤細胞數至1×107～3×107個/ml移至培養平皿中，然后加入經紫外線滅活的痘苗病毒，相當于1×108～3×108個空斑形成單位(PFU)、感染倍數(Moi)為10，在37℃及5%CO2下溫育30分鐘且每隔15分鐘搖動一次。之后加入人AB型血清使之最終濃度成為5%。然后再在37℃及5%CO2下繼續培養3.5小時且每隔30分鐘搖動一次，之后以1000轉/分離心8分鐘，取細胞沉淀向內加入100μg/ml的β-欖香烯10ml，然后在37℃溫育30～60分鐘，之后以1000轉/分離心8分鐘，取細胞沉淀向其內加入0.0125%戊二醛和0.5mg/ml短小棒狀桿菌(CP)，調整細胞數為1×107個/ml，封裝入2ml的安瓶中1ml/支。(此前檢查瘤苗細胞形態完整性及并取材檢菌)，最后置于4℃冰箱避光保存，該制備過程所得的外觀為無色半透明混懸液即為結腸癌Ⅱ型痘苗病毒混合瘤苗。
例3重復實施例1中制備單個細胞懸液的操作。用RPMI1640培養液(含常規量慶大霉素、HEPES、NaHCO3、PH＝7.2～7.4)調整細胞濃度至1×107～3×107個/ml移至培養平皿中。然后加入新城雞瘟病毒1000血凝單位(HU)，在37℃及5%CO2下溫育30分鐘，每隔10分鐘輕輕搖勻一次。之后加入人AB型血清，使之最終濃度成為5%，然后再在37℃及5%CO2繼續培養3.5小時，每隔15～30分鐘輕輕搖勻一次，之后以1000轉/分離心8分鐘，取細胞沉淀向內加入100μg/ml的β欖香烯10ml，以下步驟同例2，得到的產物為結腸癌Ⅱ型新城雞瘟病毒混合瘤苗。
例4重復例2的操作;至以1000轉/分離心8分鐘，取細胞沉淀向內加入100μg/ml的β欖香烯10ml和100μg/ml的MMC10ml，然后在37℃溫育30～60分鐘，之后以1000轉/分離心8分鐘，重復操作2次。取細胞沉淀向其內加入2%多聚甲醛和0.5mg/ml短小棒狀桿菌(CP)調整細胞數為1×107/ml，然后用前述例中的方法包裝、存放、所得產物即為Ⅲ型痘苗病毒混合瘤苗。
例5重復例3的操作至以1000轉/分離心8分鐘，取細胞沉淀向內加入100μg/ml的β欖香烯10ml和100μg/mlMMC 10ml，然后在37℃溫育30～60分鐘，之后以1000轉/分離心8分鐘，重復操作2次。取細胞沉淀向其內加入0.0125%戊二醛和0.5mg/ml短小棒狀桿菌(CP)調整細胞數為1×107/ml，然后用前述例中的方法包裝、存放、所得產物即為Ⅲ型新城雞瘟病毒混合瘤苗。
表2各種瘤苗對L615的免疫保護效應。
處理方法動物數存活率%死亡動物的存活時間(X±SD)天莪術油2070.026.2±15.6**β-欖香烯1478.611.9±2.6MMC1573.443.0±13.7**CP和瘤細胞混合2060.033.0±20.8**戊二醛1040.09.7±0.560Co照射 30 33.3 18.0±13.6*熱滅活10010.69±0.5無細胞提取液10010.1±4.2超聲波瘤勻漿1009.9±0.5各對照組45010.6±1.5＊＊P＜0.01＊P＜0.05均與對照組比上表顯示本發明的莪術、β欖香烯瘤苗及CP和瘤細胞混合瘤苗等均顯著優于傳統60Co照射瘤苗。
表3單因素和多因素處理的腫瘤細胞(L615)的免疫保護效應比較表處理因素存活率(%)MST±SD(天)β-欖香烯66.713.5±1.5MMC8014.0±0.0戊二醛4214.5±1.3β-欖香烯+戊二醛71.317.5±0.7β-欖香烯+MMC87.515.5±0.7β-欖香烯+MMC+戊二醛88.920.0±4.2對照組09.5±0.6上表顯示β欖香烯、MMC、戊二醛復合處理免疫效果更佳。
表4痘苗病毒和β-欖香烯處理瘤苗的免疫保護效應比較表(MH134肝癌)組別存活率(%)死亡動物平均存活時間(天)β-欖香烯瘤苗42.915.5VV+β欖香烯瘤苗85.719對照組017.5
表5本發明方法與現有技術比較表現有技術本發明方法優點瘤單因素處理復合因素處理1)用抗癌中藥及其有效苗1)放射線(X線、鈷60)1)莪術油或其有效成分成分制備瘤苗均屬首創制2)絲裂霉素C(MMC)β-欖香烯+MMC2)莪術油或β-欖香烯瘤備3)病毒(感染的腫瘤細2)病毒(VV或NDV)+苗的保護效應高于經典胞或病毒溶瘤物)β-欖香烯(或OCA)法鈷60照射瘤苗,存活4)分離提純的腫瘤相3)病毒(VV或NDV)+β率分別為70～80%與30關抗原-欖香烯(或OCA)+MMC～40%3)復合處理方法其療效更優于單因素處理.
瘤液氮凍存活細胞用時采用醛類固定劑既可充分滅能保證安全苗復蘇(有時還需經培養又可長期保存保擴增達到一定數量時存才能重新制備瘤苗)使用結核桿菌(BCG)或精短小棒狀桿菌(CP)1)CP為死菌苗安全、時所制蛋白衍生物(結核死菌苗在制備瘤苗有效、方便.
用佐菌素PPD)與瘤苗免時同時加入成混合2)本發明將瘤苗制備、劑疫注射時并用瘤苗保存及佐劑使用在一個流程內解決,可在普通條件下長期保存備用.
表6本發明中瘤苗的保存方法與現有技術比較表比較項目本發明方法現有方法基本方法采用醛類固定劑用液氮冷凍達到的效能保證達到滅能(瘤細胞是死是活瘤細胞凍存應用的)滅菌、防毒(病毒)而保時需復蘇重新制備瘤苗存其增高的免疫原性(實際上不是瘤苗的保存)操作手續在制備瘤苗的流程中凍存要加二甲基亞砜、一次解決,十分簡便人血清白蛋白,最好有專門的液氮冷凍溫控儀,保存期要向液氮罐內定期加液氮復蘇后還要立即將二甲基亞砜洗去.
費用只需少量固定劑成本要有專門設備、長期十分低廉(<0.1元/支)消耗液氮和冷凍用制劑安全性絕對安全冷凍、復蘇及瘤苗制(>50元/支)備過程仍要注意操作的安全性.
可靠性一般置4℃就可保存如液氮凍存一般可保存置-20℃以上的低溫冰一年以上,但復蘇成箱可長期保存功率不一定是100%.
推廣、應用保存運輸均極為方便使不便于保存、運輸與開發自體瘤苗、異體瘤苗以不易推廣、開發至建立"瘤苗庫"均可實現.
注本發明中，除特殊標明的之外均為重量百分比。
權利要求
1.一種腫瘤疫苗的制備方法，其先要制備單個瘤細胞懸液，即將腫瘤組織制成1mm3的小塊，洗滌后依次用胰酶(0.14%)、DNA酶(0.03%)消化，置4℃8～16小時，再經搖床震蕩30分鐘，然后用200目不銹鋼網過濾，濾液被離心洗滌之后用氯化銨緩沖液處理，可得到單個瘤細胞懸液，其特征在于細胞水平瘤苗的制備如下Ⅰ型瘤苗將上述單個瘤細胞懸液與等體積的200～400μg/ml的莪術油或100～200μg/ml的β-欖香烯及終濃度為50～100μg/ml的MMC處理60～120分鐘，離心洗滌后加入醛類固定劑，再與短小棒狀桿菌(CP)混合成為混合瘤苗，或Ⅱ型瘤苗向上述單個瘤細胞懸液加入新城雞瘟病毒(NDV)按100--1000血凝單位(HU)/3×106～7瘤細胞或者用紫外線滅能的痘苗病毒(UV--VV)按感染倍數(Moi)為10的比例處理，于37℃5%CO2下溫育4小時，離心洗滌后再分別與等體積的200～400μg/ml莪術油或100～200μg/mlβ-欖香烯混合，再于37℃溫育30～60分鐘，離心后向細胞沉淀加入醛類固定劑并與CP混合，或Ⅲ型瘤苗向上述單個瘤細胞懸液加入新城雞瘟病毒(NDV)按100～1000血凝單位(HU)/3×106～7瘤細胞或者用紫外線滅能的痘苗病毒(UV--VV)按感染倍數(Moi)為10的比例處理，于37℃、5%CO2下溫育4小時，離心洗滌后再分別與等體積的200～400μg/ml莪術油+MMC或100～200μg/mlβ-欖香烯+MMC混合，再于37溫育30～60分鐘，離心后向細胞沉淀加入醛類固定劑并與CP混合。
2.根據權利要求1所述的腫瘤疫苗的制備方法，其特征在于醛類固定劑為0.0125%的戊二醛。
全文摘要
一種腫瘤疫苗的制備方法，其先采用常規方法制成單個瘤細胞懸液，將它用β-欖香烯(或莪術油)和MMC處理，然后加入醛類固定劑并與CP混成I型瘤苗。或將單個瘤細胞懸液用病毒處理，其可以是紫外線滅能的痘苗病毒也可以是新城雞瘟病毒，它們再分別與β-欖香烯(或莪術油)或β-欖香烯(或莪術油)+MMC混合，再加入醛類固定劑并與CP混合分別得到II型和III型瘤苗。本發明的方法制備的腫瘤疫苗滅能徹底、保存方便、療效高。
文檔編號A61K39/00GK1097142SQ93112060
公開日1995年1月11日 申請日期1993年7月5日 優先權日1993年7月5日
發明者錢振超, 王大慶, 劉金友, 魏文漢, 金成剛 申請人:大連醫學院