專利名稱：一種hiv-1脂質(zhì)體疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物預(yù)防醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種預(yù)防艾滋病的HIV-I脂質(zhì)體疫苗的制備。
背景技術(shù)：
艾滋病是全球所面臨的最重大挑戰(zhàn)之一，嚴(yán)重危害社會(huì)進(jìn)步與經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)，已造成 6000多萬(wàn)人被感染，其中3000萬(wàn)人已經(jīng)死亡，目前存活的感染者約為3320萬(wàn)，其中90%以上的病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。至今為止，在各國(guó)政府與國(guó)際組織強(qiáng)有力的支持下，世界上先后開(kāi)展了 100多個(gè)臨床試驗(yàn)，但尚未有一個(gè)成功上市的艾滋病疫苗。艾滋病疫苗研制困難的一個(gè)主要原因是由于艾滋病病毒的特殊性，即HIV-I具有高度的變異性。以往的疫苗所選擇的抗原表位主要是自然感染中的優(yōu)勢(shì)抗原表位，而這些抗原表位是HIV-I中變異頻率最高的位點(diǎn)。因此， 以這些抗原構(gòu)建的疫苗誘導(dǎo)出的抗體具有延遲性，無(wú)法中和已經(jīng)發(fā)生突變的HIV-I。通過(guò)保守免疫原設(shè)計(jì)來(lái)誘導(dǎo)具有廣譜保護(hù)作用新疫苗是解決現(xiàn)有艾滋病疫苗研究中所存在的問(wèn)題一個(gè)重要研究方向。高度保守的HIV-I gp41 MPER被認(rèn)為是最具潛力的中和抗體設(shè)計(jì)靶點(diǎn)。目前為止分離得到的五個(gè)廣泛中和抗體有三個(gè)(2F5，4E10和Z13抗體)是識(shí)別該區(qū)域的，其中4E10 能以較低的濃度中和HIV-I原始病毒株在內(nèi)22株病毒株的全部亞型病毒，2F5可中和大約 67%左右的病毒。但是，無(wú)論在真核還是原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)gp41或截短的gp41片段作為抗原時(shí)，由于獲得的蛋白溶解性較差，很難產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種用于預(yù)防艾滋病的HIV-I脂質(zhì)體疫苗。本發(fā)明將HIV-I gP41的MPER段較保守的抗原核心表位共價(jià)偶聯(lián)到脂質(zhì)體表面， 模擬HIV病毒env的天然狀態(tài)，同時(shí)在抗原序列中加入通用的輔助性T細(xì)胞表位，通過(guò)B、T 細(xì)胞雙信號(hào)識(shí)別，有助于增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，并能產(chǎn)生廣譜的保護(hù)作用。其中HIV-I gP41的MPER段較保守的抗原核心表位包括但不限于4E10和/或2F5 所識(shí)別的核心表位，抗原序列中加入通用的輔助性T細(xì)胞表位包括但不限于破傷風(fēng)毒素 830-843序列和/或口蹄疫病毒VPI上200-213序列。經(jīng)豚鼠免疫實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)到較高滴度的針對(duì)HIV-I gP41的MPER的抗體，并具有一定的中和活性。


圖1為本發(fā)明脂質(zhì)體與抗原表位肽共價(jià)偶聯(lián)反應(yīng)示意圖。馬來(lái)酰亞胺活化的磷脂在PH中性條件下與抗原表位肽的巰基發(fā)生邁克爾加成，從而將脂質(zhì)體與抗原偶聯(lián)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1抗原表位的設(shè)計(jì)選取HIV-I gp41 MPER上的4E10和/或2F5識(shí)別表位作為B細(xì)胞表位，加入通用 T細(xì)胞輔助表位，中間以6-氨基己酸連接。ELLELDKWASL-Ahx-QYIKANSKFIGITEC(Pl1)；ELLELDKffASL-Ahx-AKFVAAffTLKAAAC(P12)；SLNWFNITNWL-Ahx-QYIKANSKFIGITEC(P21)；SLNWFNITNWL-Ahx-AKFVAAffTLKAAAC(P22)；NEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK-Ahx-QYIKANSKFIGITEC(P31)；NEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK-Ahx-AKFVAAffTLKAAAC(P32)。實(shí)施例2HIV-I脂質(zhì)體疫苗的制備利用薄膜分散法、反相蒸發(fā)法、乙醇注入法、凍干重建法等常用脂質(zhì)體制備方法制備空白脂質(zhì)體，脂質(zhì)體膜材中加入馬來(lái)酰亞胺活化的磷脂或其他脂溶性物質(zhì)。在PH 中性條件下與抗原表位肽的巰基發(fā)生邁克爾加成，從而將脂質(zhì)體與抗原偶聯(lián)，反應(yīng)原理如圖1所示。以二油脂酰乙酰膽堿膽固醇心磷脂馬來(lái)酰亞胺活化磷脂酰乙醇胺 (P0PC Chol CL MPB-PE) = 8 10 1 1(摩爾比)制備脂質(zhì)體，將Pll加入上述空白脂質(zhì)體，Pll 脂類的重量比為1 20，pH 6.6 6.7、4°〇攪拌1釙得？11脂質(zhì)體疫苗 (Liposome Pll)。相同方法制備P12脂質(zhì)體疫苗(Liposome P12)。GFC、RP_HPLC檢測(cè)偶聯(lián)率，結(jié)果顯示約50%的ft·偶聯(lián)到脂質(zhì)體上。實(shí)施例3HIV-I脂質(zhì)體疫苗的豚鼠免疫實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分5組，每組豚鼠5只。組1 弗式佐劑空白；組2 =Pr+弗式佐劑；組3 空白脂質(zhì)體+MPL佐劑空白；組4:LipOSOme I^r+MPL佐劑。豚鼠皮下(四肢)多點(diǎn)注射，初免后每隔15天加強(qiáng)1次，0. 5ug/g體重。初免及加強(qiáng)采用Liposome Pll和Liposome P12 交替進(jìn)行，四免后心臟取血檢測(cè)針對(duì)MPER的抗體產(chǎn)生情況，根據(jù)抗體效價(jià)進(jìn)行中和活性評(píng)價(jià)。結(jié)合抗體檢測(cè)流程SA包被well — BSA封閉一bio-MPER —待測(cè)血清一羊抗豚鼠 IgG-HRP — TMB — 2MH2S04 — OD450。針對(duì)MPER的抗體產(chǎn)生情況見(jiàn)表1?？贵w中和活性評(píng)價(jià)見(jiàn)表2。表1
權(quán)利要求
1.一種HIV-I脂質(zhì)體疫苗，其特征在于脂質(zhì)體表面共價(jià)鍵偶聯(lián)HIV-lgP41的MPER段較保守的抗原核心表位，同時(shí)在抗原序列中加入通用的輔助性T細(xì)胞表位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HIV-I脂質(zhì)體疫苗，其特征在于所述HIV-IgP41的MPER段較保守的抗原核心表位包括但不限于4E10和/或2F5所識(shí)別的核心表位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HIV-I脂質(zhì)體疫苗，其特征在于所述抗原序列中加入通用的輔助性T細(xì)胞表位包括但不限于破傷風(fēng)毒素830-843序列和/或口蹄疫病毒200-213序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HIV-I脂質(zhì)體疫苗，其特征在于所述脂質(zhì)體的膜材包括但不限于心磷脂、神經(jīng)鞘磷脂、腦磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酸、膽固醇、飽和及不飽和的磷脂酰膽堿、馬來(lái)酰亞胺活化的磷脂或其他脂溶性物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的HIV-I脂質(zhì)體疫苗，其特征在于所述脂質(zhì)體的的制備方法包括薄膜分散法、反相蒸發(fā)法、乙醇注入法、凍干重建法。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5所述的HIV-I脂質(zhì)體疫苗，其特征在于脂質(zhì)體粒徑為 10nm-50μ m。
7.權(quán)利要求6中的HIV-I脂質(zhì)體疫苗可用于肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、腹腔注射、 口服給藥、肺部給藥、鼻腔給藥、口腔給藥、陰道肛門給藥。
8.權(quán)利要求7中的HIV-I脂質(zhì)體疫苗在初免及加強(qiáng)免疫過(guò)程中可采用同種抗原核心表位-輔助T細(xì)胞表位，也可以同種抗原核心表位-不同輔助T細(xì)胞表位交替進(jìn)行免疫。
全文摘要
具體涉及一種預(yù)防艾滋病的HIV-1脂質(zhì)體疫苗的制備。本發(fā)明通過(guò)共價(jià)鍵將HIV-1gP41的MPER段較保守的抗原核心表位偶聯(lián)到脂質(zhì)體表面，模擬HIV病毒env的天然狀態(tài)，同時(shí)在抗原序列中加入通用的輔助性T細(xì)胞表位，通過(guò)B、T細(xì)胞雙信號(hào)識(shí)別，有助于增強(qiáng)機(jī)體對(duì)抗原的免疫應(yīng)答，并能產(chǎn)生廣譜的保護(hù)作用。
文檔編號(hào)A61K39/21GK102485273SQ20101056768
公開(kāi)日2012年6月6日 申請(qǐng)日期2010年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月1日
發(fā)明者孔維, 張勇, 董慶光, 陳妍 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)