專利名稱：以黃皮屬植物中的咔唑生物堿為抗腫瘤活性成分的藥物組合物及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于藥物技術領域，具體地，涉及以黃皮屬植物中咔唑生物堿為活性成分的藥物組合物，其制備方法，其作為腫瘤細胞生長抑制劑，其在制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
當今世界，腫瘤嚴重威脅著人類的健康和生命，其死亡率僅次于心血管疾病而位居第二，成為當今人類醫學界一大難題。據世界衛生組織最近發表的報告，在28個工業化國家內，男性癌癥死亡率上升55%，女性上升40%，其中胃癌居首位，其他依次為食道癌、肝癌、子宮頸癌和腸癌等。隨著分子腫瘤學的發展，人們發現細胞內促增殖系統成分的過度表達與抑增殖系統成分的缺失均可引起細胞增殖失控而導致癌變。隨著生命科學研究的飛速 進展，惡性腫瘤細胞內的信號轉導、細胞周期的調控、細胞凋亡的誘導、血管生成以及細胞與胞外基質的相互作用等各種基本過程正在被逐步闡明。目前抗腫瘤藥物的來源主要包括植物、動物、微生物、礦物和海洋生物的代謝產物及其人工合成和人工修飾等產物。根據其作用機理的不同，抗腫瘤藥物又可分為以下幾類
(I)細胞毒類抗腫瘤藥；(2)以細胞信號轉導分子為靶點的抗腫瘤藥物；(3)腫瘤新生血管生成抑制藥物；(4)腫瘤細胞誘導分化劑；(5)細胞周期依賴性蛋白激酶抑制劑等。植物來源的天然產物在當今抗腫瘤藥物市場上扮演了重要角色，由于植物來源抗腫瘤藥物的作用機制獨特、抗癌療效顯著，如今在臨床上已經逐步占據了主導地位，達到40%的市場份額，但其資源來源和成本問題仍然困擾著這些藥物的廣泛推廣和使用，如臨床使用的植物來源的生物堿類型的抗腫瘤藥物紫杉醇化3(1；^3161)、喜樹堿(0311^101116(3；[11)和長春堿(vinblastine)等均面臨這些問題。目前已經報道的應用于抗腫瘤藥物研究的天然產物包括多種結構類型，除上述提到的具有代表性的生物堿類化合物外，還有萜類、木脂素類和黃酮類等，但是尚未見到已經上市的咔唑生物堿類抗腫瘤藥。咔唑類生物堿及其衍生物是一類重要的含氮芳雜環化合物，分子內含有較大的共軛體系和強的分子內電子轉移，這種特殊的剛性稠環結構使咔唑生物堿類化合物表現出許多獨特的生物活性，例如細胞毒、抗微生物、抗氧化、抗結核、抗艾滋、乙酰膽堿酯酶抑制、拓撲異構酶抑制等。目前已有一些合成出來的咔唑生物堿類藥物進入臨床試驗，例如Cephalon公司的抗腫瘤新藥CEP-9722已經進入臨床二期，該藥是一個合成的咔唑生物堿，以多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-2為祀標，該藥經臨床觀察無明顯的毒副作用；Cephalon公司的另一個咔唑類的抗腫瘤新藥CEP-11981進入臨床一期，該藥以Tek酪氨酸激酶受體和血管內皮生長因子受體作為靶標。另外還有一些合成的咔唑生物堿類化合物體內外都表現出了良好的研發前景，例如中國醫學科學院的Hu LX合成的咔唑生物堿類化合物9-ethyl-N-(3，4，5-trimethoxyphenyl) -carbazole-3-sulfonamide 體外對腫瘤細胞株 MCF-7 的細胞毒活性IC50達到89nM，而體內試驗給藥100mg/kg，腫瘤抑制率達到75%，而LD5tl為500mg/kg。參見Hu LXj et al， Synthesis and structure-activity relationships of carbazolesulfonamides as a novel class of antimitotic agents against solid tumors,J. Med. Chem. , 2006，49，6273-6282。C印halon公司的另一個咔唑生物堿類化合物CEP-5214對腫瘤細胞株VEGF-R2的體外IC5。達到4nM，體內給藥23. 8mg/kg，腫瘤抑制率達到70%，沒有觀察到明顯的毒副作用。參見Gingrich DEj et al, A new class ofpotent vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors:Structure-activity relationships for a series of 9-alkoxymethyl-12-(3-hydroxypropyl)indeno[2，l_a]pyrrolo[3，4_c]carbazole-5-ones and the identification ofCEP-5214 and its dimethylglycine ester prodrug clinical candidate CEP-7055， J.Med. Chem.，2003，46，5375-5388。另外也有一些來自天然的咔唑生物堿類化合物具有良好的抗腫瘤活性，可以作為抗腫瘤藥物的先導物，但截至目前僅限于文獻報道或專利申請，尚未進入臨床試驗階段，例如YH Taufiq-Yap等從小葉臭黃皮中得到的咔唑生物堿類化合物 clausine-TY對腫瘤細胞株 CEM-SS 的 IC5tl 為 8. 2 ii g/mL。參見Tauf iq-Yap YH, etal, A new cytotoxic carbazole alkaloid from Clausena excavate, Nat. Prod. Res.,2007, 21, 810-813。WManeerat等人從黃皮根部分離得到咔唑生物喊mafaicheenamineE 對腫瘤細胞株 MCF-7 的 IC5tl 達到 3.1 u g/mL。參見Maneerat W，et al. Carbazolealkaloids and coumarins from Clausena lansium roots, Phytochem. Lett. , 2012,5, 26-28。T Thongthoom等從Clausena harmandiana根部分離得到的咔唑生物喊類化合物 7-methoxymukonal 對腫瘤細胞株 MCF-7 和 KB 的 IC50 分別達到 2. 21 u g/mL 和1. 74 u g/mL0參見Thongthoom T, et al. Biological activity of chemical constituents fromClausena harmandiana, Arch. Pharmacal Res. , 2010, 33, 675-680。咔唑生物喊類化合物在植物界分布廣泛，尤其以蕓香科黃皮屬植物中最為豐富。黃皮屬植物在我國南方分布廣，容易生長栽培，資源豐富，從黃皮屬植物中分離到的咔唑生物堿類化合物含量大、種類多、分離提取容易、抗腫瘤活性強，對咔唑生物堿進行抗腫瘤藥物方面的研究有利于黃皮屬植物資源的綜合開發利用。本專利中申請保護的四個咔唑生物堿類化合物具有較強的細胞毒活性，目前尚未發現有文獻報道。黃皮屬植物中的咔唑生物堿類化合物的提取分離有一定的特點，該類天然產物主要分布于植物的根和莖，含色素，化合物極性大多數中等偏小，含量不同，另外由于該類化合物結構中含有較大的共軛體系，因此紫外吸收比較強，在分離純化時可充分利用該特點。現有技術中，從黃皮屬植物中分離咔唑生物堿類化合物已公開發表如下方法(I) 20世紀80年代，黃皮屬植物Clausena harmandiana的根莖經正己燒回流提取,用TLC檢測,經反復娃膠柱層析分離得到咔唑生物堿heptaphylline。參見Wangboonskul JD, et al, FiveCoumarins and a carbazole alkaloid from the root bark of Clausena harmandiana,J. Nat. Prod. , 1984，47，1058-1059。其缺點是用正己烷提取樣品不充分，只利用TLC檢測和硅膠柱層析進行分離得不到微量成分。(2) 20世紀90年代，黃皮屬植物Clausenaanisata的莖由石油醚和乙醇分別提取，然后用氯仿和乙酸乙酯分別萃取，再經硅膠柱層析，分別以石油醚，石油醚/ 二氯甲烷1: 1，氯仿，氯仿/甲醇1:50為洗脫劑反復硅膠柱層析得到咔唑生物喊 clausenol 和 clausenine。參見Chakraborty A, et al, Clausenoland clausenine-Two carbazole alkaloids from Clausena anisata, Phytochemistry,1995，40，295-298。其缺點是只用正相硅膠，沒有應用反相硅膠，容易吸附微量樣品。
(3)近年來,黃皮屬植物Clausena anisata的莖經干燥粉碎后分別由丙酮和甲醇進行回流提取，得到的浸膏經反復硅膠柱層析及TLC制備薄層板進行分離純化得到咔唑生物IjlEfuranoclausamine A 和 furanoclausamine B。參見Ito C，et al. gamma-Lactonecarbazoles from Clausena anisata, J. Nat. Prod. , 2009, 72, 1202-1204。該方法的缺點是薄層制備板只適用于微量成分，且容易吸附樣品。以上幾種方法側重于使用正相硅膠，反相硅膠幾乎沒有使用，容易損失樣品；單一的TLC檢測方法靈敏度不夠，微量成分不容易檢測，沒有充分利用咔唑生物堿紫外吸收強的特點。

發明內容
針對現有技術存在的上述不足之處，本發明的目的在于提供一類咔唑生物堿；提供制備該類化合物的方法，該提取分離方法可控性和重現性好，樣品損失少，成本較低，操作方便，溶劑可以反復回收利用，也適用于工業生產；本發明的目的還在于提供以咔唑生物堿類化合物為有效成分的藥物組合物；該類化合物作為腫瘤細胞生長抑制劑，以及在制備抗腫瘤藥物中的應用。為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下技術方案藥物組合物，其中含有治療有效量的如下結構式所示的黃皮屬植物中的咔唑生物M clausine D (I)、6_methoxyheptaphylline (2)、mafaicheenamine C (3)和 claulansine
G (4)或其藥理學上容許的鹽和藥學上可接受的載體。
權利要求
1.藥物組合物，其中含有治療有效量的如下結構式所示的黃皮屬植物中的咔唑生物堿 clausine D (I)、6_methoxyheptaphylline (2)、mafaicheenamine C (3)、claulansine G(4)或其藥理學上容許的鹽和藥學上可接受的載體
2.制備權利要求1中所述咔唑生物堿的方法，取黃皮屬植物的根莖，經干燥、粉碎后， 用甲醇回流充分提取；將甲醇浸膏加水混懸后，依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取；乙酸乙酯部分反復用硅膠、S^hadex LH-20、MC1、RP-18和HPLC等各種層析柱分離純化，再結合 TLC檢測方法即得到咔唑生物堿類化合物。
3.制備權利要求1中所述咔唑生物喊clausineD (I )、6_methoxyheptaphylline (2)、 mafaicheenamine C (3)和claulansine G (4)的方法，取黃皮的根莖，經干燥、粉碎后, 用甲醇回流提取3次，時間為每次4小時，提取液經減壓濃縮得甲醇浸膏；將甲醇浸膏加水混懸后，依次用乙酸乙酯和正丁醇充分萃取，等體積各萃取三次，回收溶劑得到乙酸乙酯部分、正丁醇部分和水部分；將乙酸乙酯部分經硅膠柱層析，用100:0，95:5, 90:10的氯仿 /甲醇梯度洗脫，薄層層析，結合TLC檢測方法，根據咔唑生物堿極性的不同合并為七個組分Fr.1 - Fr. 7 ;以下的每一步驟都須結合TLC檢測方法來進行分離純化，Fr. 2用60目的聚酰胺拌樣，以甲醇和水做流動相經中壓MCI柱層析10%-100%梯度洗脫除去色素，然后娃膠柱層析，用9:1-7:3石油醚/乙酸乙酯為洗脫劑梯度洗脫分離得到四個亞組分Fr. 2-1 -Fr. 2-4 ；Fr. 2-2再經硅膠柱層析以9:1-7:3石油醚/乙酸乙酯為洗脫劑梯度洗脫分離得到四個亞組分Fr. 2-2-1 - Fr. 2-2-4 ；Fr. 2-2-1經兩次硅膠柱層析，以9:1-7:3石油醚 /乙酸乙酯為洗脫劑梯度洗脫除去一部分雜質，得到的樣品濃縮后再經Waters OBD制備柱60%乙腈/水等度洗脫純化，純化出來的樣品濃縮后再以丙酮為溶劑重結晶得到化合物 6-methoxyheptaphy 11 ine (2) ；Fr. 6經娃膠柱層析，以9:1-7:3石油醚/丙酮為洗脫劑梯度洗脫初步除去色素，然后再經中壓MCI柱層析，以10%-60%甲醇/水為流動相梯度洗脫進一步除去色素，然后再用中壓RP-18柱層析，以5%-70%甲醇/水為流動相梯度洗脫得到四個亞組分Fr. 6-1 - Fr. 6-4 ；Fr. 6-1經硅膠柱層析，以20:1氯仿/丙酮為洗脫劑等度洗脫進一步分離得到三個亞組分 Fr. 6-1-1 - Fr. 6-1-3 ;Fr. 6-1-1 經 Sephadex LH-20 層析，1:1，的氯仿/甲醇為洗脫劑等度洗脫得到的樣品濃縮后再經硅膠柱層析，以9:1石油醚/丙酮為洗脫劑等度洗脫分離得到化合物claulansine G (4) ；Fr. 6-1-2經娃膠柱層析，以20:1 氯仿/乙酸乙酯為洗脫劑等度洗脫分離得到含有生物堿的樣品，再經Waters OBD制備柱， 以48%的乙腈/水(含O. 6%的三氟乙酸)為洗脫劑等度洗脫得到化合物mafaicheenamine C (3)；Fr. 6-3經硅膠柱層析，以9:1石油醚/丙酮為洗脫劑等度洗脫得到含有生物堿的樣品，該樣品以丙酮為溶劑重結晶得到化合物clausine D (I)。
4.以權利要求1中所述的咔唑生物堿或其藥理學上容許的鹽為有效成分的腫瘤細胞生長抑制劑。
5.抗腫瘤藥物組合物，其中含有治療有效量的權利要求1中所述的咔唑生物堿或其藥理學上容許的鹽和藥學上可接受的載體。
6.權利要求1中所述的咔唑生物堿或其藥理學上容許的鹽在制備腫瘤細胞生長抑制劑中的應用。
7.權利要求1中所述的咔唑生物堿或其藥理學上容許的鹽在制備治療抗腫瘤相關疾病的藥物中的應用。
8.權利要求1中所述的咔唑生物堿或其藥理學上容許的鹽在制備胃癌、宮頸癌、肺癌細胞生長抑制劑中的應用。
9.權利要求1中所述的咔唑生物堿或其藥理學上容許的鹽在制備治療胃癌、宮頸癌、 肺癌的藥物中的應用。
全文摘要
以咔唑生物堿clausine D(1)、6-methoxyheptaphylline(2)、mafaicheenamine C(3)或claulansine G(4)為活性成分的藥物組合物。它們的制備方法，它們在制備腫瘤細胞生長抑制劑中的應用，以及在制備抗腫瘤藥物中的應用。
文檔編號A61P11/00GK102988356SQ20131000548
公開日2013年3月27日 申請日期2013年1月8日 優先權日2013年1月8日
發明者譚寧華, 宋衛武, 曾廣智, 彭文文 申請人:中國科學院昆明植物研究所