專利名稱：Cgrp抗體的制作方法
CGRP抗體
本發(fā)明在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)，特別是在降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的抗體的領(lǐng)域內(nèi)。更具體而言，本發(fā)明涉及CGRP抗體和CGRP抗體用于骨關(guān)節(jié)炎疼痛或偏頭痛療法中的用途。
降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)是由中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)分泌的37個(gè)氨基酸的神經(jīng)肽。CGRP廣泛分布于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的感覺(jué)神經(jīng)中，并表現(xiàn)出多種不同的生物學(xué)活性。據(jù)報(bào)道CGRP具有功能。當(dāng)從三叉神經(jīng)和其他神經(jīng)纖維釋放時(shí)，認(rèn)為CGRP通過(guò)結(jié)合特定的細(xì)胞表面受體來(lái)介導(dǎo)其生物學(xué)應(yīng)答。
據(jù)報(bào)道CGRP在偏頭痛中發(fā)揮作用，因?yàn)镃GRP是當(dāng)感覺(jué)神經(jīng)受刺激時(shí)釋放的，并具有強(qiáng)效的血管舒張活性。當(dāng)這些纖維受到刺激時(shí)，CGRP的釋放增加了血管滲透性及隨后的在受三叉神經(jīng)纖維神經(jīng)支配的組織中的血漿蛋白滲漏(血漿蛋白外滲)。此外，研究還報(bào)道了在患偏頭痛的患者中灌注CGRP導(dǎo)致偏頭痛樣癥狀。
還報(bào)道了 CGRP在骨關(guān)節(jié)炎(OA)中發(fā)揮作用。OA是在世界范圍影響高百分比人群的慢性病況。關(guān)節(jié)炎疼痛由痛覺(jué)過(guò)敏(對(duì)正常的無(wú)害刺激過(guò)度敏感)和自發(fā)性疼痛(休息時(shí)疼痛)表征。關(guān)節(jié)的炎癥導(dǎo)致外周和中樞致敏。在外周致敏中，通常高閾值的含CGRP的傷害性感受器開(kāi)始應(yīng)答于與正常關(guān)節(jié)活動(dòng)相關(guān)的輕微壓力。CGRP作為炎癥過(guò)程的局部促進(jìn)劑發(fā)揮作用。這一持續(xù)的過(guò)程最終導(dǎo)致脊髓的中樞致敏，使神經(jīng)元變得應(yīng)答發(fā)炎的和非發(fā)炎的組織的刺激。在大鼠的OA疼痛的臨床前模型中，觀察到CGRP陽(yáng)性神經(jīng)纖維數(shù)量的增加，與疼痛量正相關(guān)。
OA疼痛的現(xiàn)有護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)由非類固醇抗炎藥物(NSAID)和選擇性Cox_2抑制劑組成。隨時(shí)間推移，許多患者將變得對(duì)這些治療不敏感，或者不能耐受有效緩解疼痛所需的高劑量。后續(xù)治療由關(guān)節(jié)內(nèi)注射(乙酰透明質(zhì)酸)或阿片劑組成。最后的治療是手術(shù)全關(guān)節(jié)替換。許多這類治療具有負(fù)面的副作用，范圍從胃腸道(NSAID)至心血管(Cox-2抑制劑)， 是棘手和/或不太有效的(關(guān)節(jié)內(nèi)注射)、具有濫用的風(fēng)險(xiǎn)(阿片劑)，或僅限于I個(gè)關(guān)節(jié) (關(guān)節(jié)內(nèi)注射、手術(shù))。
雖然已經(jīng)公開(kāi)了用于治療偏頭痛和用于治療炎癥疼痛的CGRP抗體(偏頭痛-WO 2007/076336 和 WO 2007/054809 ；0A-參見(jiàn) W02009/109908A1 的抗體 Gl)，但仍然需要備選物。優(yōu)選的，治療備選物是安全有效的。更優(yōu)選地，OA的備選的治療可提供對(duì)多個(gè)關(guān)節(jié)的長(zhǎng)期持續(xù)的疼痛緩解，這對(duì)于患者是可耐受的，沒(méi)有依賴性和/或?yàn)E用的風(fēng)險(xiǎn)。
本發(fā)明提供了人的工程CGRP抗體，其包含輕鏈可變區(qū)(LCVR)和重鏈可變區(qū) (HCVR)，其中所述LCVR包含LCDRl。LCDR2和LCDR3氨基酸序列，并且HCVR包含HCDRl、 HCDR2和HCDR3氨基酸序列，所述氨基酸序列選自
a)LCDRl 是 RASQDIDNYLN(SEQ ID NO 3), LCDR2 是 YTSEYHS(SEQ ID NO 4), LCDR3 是 QQGDALPPT(SEQ ID NO 5), HCDRl 是 GYTFGNYWMQ(SEQ ID NO: 12)，HCDR2 是 AIYEGTCDTRYIQKFAG(SEQ ID NO : 13)，并且 HCDR3 是 LSDYVSGFSY (SEQ ID NO 14)；
b)LCDRl 是 RASQDIDNYLN(SEQ ID NO 3), LCDR2 是 YTSEYHS(SEQ ID NO 4), LCDR3 是 QQGDALPPT(SEQ ID NO 5), HCDRl 是 GYTFGNYWMQ(SEQ ID NO: 12)，HCDR2 是 AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO : 15)，并且 HCDR3 是 LSDYVSGFSY (SEQ ID NO 14)；
c)LCDRl 是 RASKDISKYLN(SEQ ID NO 6), LCDR2 是 YTSGYHS(SEQ ID NO 7), LCDR3 是 QQGDALPPT(SEQ ID NO 5), HCDRl 是 GYTFGNYWMQ(SEQ ID NO 12), HCDR2 是 AIYEGTGKTVYIQKFAD (SEQ ID NO : 16)，并且 HCDR3 是 LSDYVSGFGY (SEQ ID NO 39)；
d)LCDRl 是 RASRPIDKYLN(SEQ ID NO 8), LCDR2 是 YTSEYHS(SEQ ID NO 4), LCDR3 是 QQGDALPPT(SEQ ID NO 5), HCDRl 是 GYTFGNYWMQ(SEQ ID NO: 12)，HCDR2 是 AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO : 15)，并且 HCDR3 是 LSDYVSGFGY (SEQ ID NO 39);和
e)LCDRl 是 RASQDIDKYLN(SEQ ID NO 9), LCDR2 是 YTSGYHS(SEQ ID NO 7), LCDR3 是 QQGDALPPT(SEQ ID NO 5), HCDRl 是 GYTFGNYWMQ(SEQ ID NO: 12)，HCDR2 是 AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO 15)，并且 HCDR3 是 LSDYVSGFGY (SEQ ID NO 39)，
其中，人的工程CGRP抗體結(jié)合人CGRP。
本發(fā)明提供了包含LCVR和HCVR的人的工程CGRP抗體，其中LCDRl是SEQ ID NO: 3，LCDR2 是 SEQ ID NO :4，LCDR3 是 SEQ IDNO :5，HCDRl 是 SEQ ID NO :12，HCDR2 是 SEQ ID NO :13，并且HCIR3是SEQ ID NO : 14，其中人的工程CGRP抗體結(jié)合人CGRP。本發(fā)明提供了包含LCVR和HCVR的人的工程CGRP抗體或其抗原結(jié)合片段，其中IXDRl是SEQ ID NO :3， LCDR2 是 SEQ ID NO :4，LCDR3 是 SEQ ID NO :5，HCDRl 是 SEQ ID NO :12，HCDR2 是 SEQ ID NO :15，并且HCDR3是SEQ ID NO : 14，其中人的工程CGRP抗體結(jié)合人CGRP。本發(fā)明提供了包含LCVR和HCVR的人的工程CGRP抗體，其中LCDRl是SEQ ID NO :6，LCDR2是SEQ ID NO 7，LCDR3 是 SEQ ID NO :5，HCDRl 是 SEQ ID NO :12，HCDR2 是 SEQ ID NO :16，并且 HCDR3 是 SEQ ID N0:39，其中人的工程CGRP抗體結(jié)合人CGRP。本發(fā)明提供了包含LCVR和HCVR的人的工程 CGRP 抗體，其中 LCDRl 是 SEQ ID NO :8，LCDR2 是 SEQ ID NO :4，LCDR3 是 SEQ ID NO :5，HCDRl 是 SEQID NO : 12，HCDR2 是 SEQ ID NO :15，并且 HCDR3 是 SEQ ID N0:39，其中人的工程CGRP抗體結(jié)合人CGRP。本發(fā)明提供了包含LCVR和HCVR的人的工程CGRP抗體， 其中 LCDRl 是 SEQ ID NO 9, LCDR2 是 SEQ ID NO 7, LCDR3 是 SEQ ID NO 5, HCDRl 是 SEQ ID NO :12，HCDR2 是 SEQ ID NO : 15，并且 HCDR3 是 SEQ ID NO :39，其中人的工程 CGRP 抗體結(jié)合人CGRP。
本發(fā)明提供了包含LCVR和HCVR的人的工程CGRP抗體，其中IXDRl是 RASX1X2IX3X4YLn (SEQ ID NO 10) , LCDR2 是 YTSX5YHS (SEQ ID NO 11) , LCDR3 是 QQGDALPPT(SEQ ID NO 5),并且 HCDRl 是 GYTFGNYWMQ(SEQ ID NO 12), HCDR2 是 AIYEGTGX6TX7YIQKFAX8 (SEQ ID NO :37)，并且HCDR3 是LSDYVSGFX9Y(SEQ ID N0:38)，其中 X1 是Q、R或K ;X2是D或P，X3是D或S，X4是N或K，X5是G或E，X6是K或D，X7是V或R，X8 是D或G，并且X9是G或S，其中抗體結(jié)合人CGRP。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含輕鏈可變區(qū)(LCVR)和重鏈可變區(qū) (HCVR)的人的工程CGRP抗體，其中LCVR包含
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASX1X2IX3X4YLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSX5
yhsgvpsrfsgsgsgtdftx6tisslqpedx7atyycqqgdalpptfgx8gtkx9eik
其中，乂1是11(或1 ;&是0或P而是0或S 4是1(或N;X5是E或6乂是？或 L ;X7 是 I 或 F ;X8 是 Q 或 G ;并且 X9 是 L 或 V。(SEQ ID NO 42)
并且HCVR包含
QVQLVQSGAEVKKPGXiSVKVSCKASGYTFGNYWMQWVRQAPGQGLEWMGAI
yegtgx2tx3yiqkfax4rvtx5tx6dx7ststx8ymelsslrsedtavyycarlsdy
VSGFX9YWGQGTX1QVTVSS，其中 X1 = A 或 S; X2 = K 或 D; X3 = V 或 R; X4 = G 或 D;
X5 = M 或 I ;X6 = R 或 A ;X7 = T 或 K ;X8 = V 或 A ;X9 = G 或 S ;并且 Xltl = L 或 T. (SEQ ID NO 43)，
其中抗體結(jié)合人CGRP。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含輕鏈可變區(qū)(LCVR)和重鏈可變區(qū) (HCVR)的人的工程CGRP抗體，其中LCVR和HCVR是選自以下的氨基酸序列
a. LCVR 是 SEQIDNO: 17 并且 HCVR 是 SEQIDNO22 ；
b. LCVR 是 SEQIDNO: 18 并且 HCVR 是 SEQIDNO23 ；
c. LCVR 是 SEQIDNO: 19 并且 HCVR 是 SEQIDNO24 ；
d. LCVR 是 SEQIDNO: 20 并且 HCVR 是 SEQIDNO 25 ；
e. LCVR 是 SEQIDNO 21 并且 HCVR 是 SEQIDNO26o
本發(fā)明提供了人的工程CGRP抗體，其包含SEQ ID NO : 17的LCVR和SEQ ID NO 22 的HCVR。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了人的工程CGRP抗體，其包含SEQ ID N0:18的 LCVR和SEQ ID NO :23的HCVR。本發(fā)明提供了人的工程CGRP抗體，其包含SEQ ID NO 19 的LCVR和SEQ ID NO :24的HCVR。本發(fā)明提供了人的工程CGRP抗體，其包含SEQ ID NO 20 的LCVR和SEQ ID NO :25的HCVR。本發(fā)明提供了人的工程CGRP抗體，其包含SEQ ID NO: 21 的 LCVR 和 SEQ ID NO 26 的 HCVR0
本發(fā)明還提供了包含輕鏈(LC)和重鏈(HC)的人的工程CGRP抗體，其中LC和HC氨基酸序列選自
a) LC 是 SEQ ID NO 27 并且 HC 是 SEQ ID NO 32 ；
b) LC 是 SEQ ID NO 28 并且 HC 是 SEQ ID NO 33 ；
c) LC 是 SEQ ID NO 29 并且 HC 是 SEQ ID NO 34 ；
d) LC 是 SEQ ID NO 30 并且 HC 是 SEQ ID NO :35 ;和
e)LC 是 SEQ OD NO 31 并且 HC 是 SEQ ID NO :36。
在實(shí)施方案中，人的工程CGRP抗體包含SEQ ID NO 27的LC和SEQ ID NO 32的 HC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人的工程CGRP抗體包含SEQ ID NO 28的LC和SEQ ID NO 33 的HC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人的工程CGRP抗體包含SEQ ID NO 29的LC和SEQ ID NO 34的HC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人的工程CGRP抗體包含SEQ ID NO :30的LC和SEQ ID NO :35的HC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人的工程CGRP抗體包含SEQ ID NO :31的LC和SEQ ID NO 36的HC。在實(shí)施方案中，人的工程CGRP抗體包含兩條輕鏈和兩條重鏈，其中每條LC氨基酸序列是SEQID NO :27并且每條HC氨基酸序列是SEQ ID NO :32。在實(shí)施方案中，人的工程CGRP抗體包含兩條輕鏈和兩條重鏈，其中每條LC氨基酸序列是SEQ ID N0:28并且每條HC氨基酸序列是SEQ ID NO 330在實(shí)施方案中，人的工程CGRP抗體包含兩條輕鏈和兩條重鏈，其中每條LC氨基酸序列是SEQ ID NO 29并且每條HC氨基酸序列是SEQ ID NO 34。在實(shí)施方案中，人的工程CGRP抗體包含兩條輕鏈和兩條重鏈，其中每條LC氨基酸序列是SEQ ID NO :30并且每條HC氨基酸序列是SEQ ID NO :35。在實(shí)施方案中，人的工程CGRP 抗體包含兩條輕鏈和兩條重鏈，其中每條LC氨基酸序列是SEQ ID NO :31并且每條HC氨基酸序列是SEQ IDNO 360本發(fā)明還提供了本文所述的抗體的抗原結(jié)合片段。
本發(fā)明還提供了這樣的人的工程CGRP抗體，所述抗體在基本如實(shí)施例4所述的測(cè)定中的IC50< Ι.ΟηΜ。在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含LCVR和HCVR的人的工程CGRP抗體，其中 LCDRl 是 SEQ ID NO :6，LCDR2 是 SEQ ID NO :7，LCDR3 是 SEQ ID NO :5，HCDRl 是 SEQ IDNO :12，HCDR2 是 SEQ ID NO :16 并且HCDR3 是SEQ ID NO :39，并且其中人的工程CGRP 抗體結(jié)合人CGRP，并在基本如實(shí)施例4所述的測(cè)定中的IC50 < I. OnM。在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了人的工程CGRP抗體，其包含SEQ ID NO 19的LCVR氨基酸序列和SEQ ID NO 24的HCVR氨基酸序列，其中人的工程CGRP抗體在基本如實(shí)施例4所述的測(cè)定中的IC50 < I. OnM0在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了人的工程CGRP抗體，其包含SEQ ID N0:29的LC氨基酸序列和SEQ ID NO 34的HC氨基酸序列，其中人的工程CGRP抗體在基本如實(shí)施例4所述的測(cè)定中的IC50 < I. OnM0
本發(fā)明還提供了人的工程CGRP抗體，其在基本如實(shí)施例4所述的測(cè)定中的IC50 <0.5nM。在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含LCVR和HCVR的人的工程CGRP抗體，其中 LCDRl 是 SEQ ID NO :6，LCDR2 是 SEQIDN0 :7，LCDR3 是 SEQ ID NO :5，HCDRl 是 SEQ ID NO 12，HCDR2是SEQ ID NO 16并且HCDR3是SEQ ID NO :39，且其中人的工程CGRP抗體結(jié)合人CGRP，并在基本如實(shí)施例4所述的測(cè)定中的IC50 < O. 5nM。在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了人的工程CGRP抗體，其包含SEQ ID NO : 19的LCVR氨基酸序列和SEQ ID N0:24的HCVR 氨基酸序列，其中人的工程CGRP抗體在基本如實(shí)施例4所述的測(cè)定中的IC50 < O. 5nM。在實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了人的工程CGRP抗體，其包含SEQ ID NO 29的LC氨基酸序列和 SEQ ID NO 34的HC氨基酸序列，其中人的工程CGRP抗體在基本如實(shí)施例4所述的測(cè)定中的 IC50 < O. 5nM。
本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的人的工程CGRP抗體或其抗原結(jié)合片段和可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的CGRP抗體，連同可藥用的載體和任選地其他治療成分的藥物組合物。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛的方法，所述方法包括向有需要的患者施用本發(fā)明的人的工程CGRP抗體或其抗原結(jié)合片段。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療偏頭痛的方法，所述方法包括向有需要的患者施用本發(fā)明的人的工程CGRP抗體或其抗原結(jié)合片段。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的人的工程CGRP抗體或其抗原結(jié)合片段，其用于療法。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛的本發(fā)明的人的工程CGRP抗體或其抗原結(jié)合片段。在另一方面，本發(fā)明提供了用于治療偏頭痛的本發(fā)明的人的工程CGRP抗體或其抗原結(jié)合片段。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明的人的工程CGRP抗體或其抗原結(jié)合片段在用于治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛中的用途。在另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了本發(fā)明的人的工程CGRP抗體或其抗原結(jié)合片段在用于治療偏頭痛中的用途。本發(fā)明還提供了人的工程CGRP抗體或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)用于治療骨關(guān)節(jié)炎的藥物中的用途。本發(fā)明還提供了人的工程CGRP抗體或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)用于治療偏頭痛的藥物中的用途。
天然存在的全長(zhǎng)抗體是包含由二硫鍵互相連接的2條重鏈(H)鏈和2條輕(L)鏈的免疫球蛋白分子。每條鏈的氨基末端部分包括約100-110個(gè)氨基酸的可變區(qū)，所述可變區(qū)通過(guò)其中包含的互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。每條鏈的羧基末端部分定義了主要負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能的恒定區(qū)。
CDR中間散布著更保守的區(qū)域，被稱為框架區(qū)(FR)。每個(gè)輕鏈可變區(qū)(LCVR)和重鏈可變區(qū)(HCVR)由3個(gè)⑶R和4個(gè)FR組成，按下列順序從氨基端至羧基端排列FR1、⑶R1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的 3 個(gè) CDR 被稱為 “LCDR1、LCDR2 和 LCDR3”，重鏈的 3 個(gè) ⑶R被稱為“HCDR1、HCDR2和HCDR3”。⑶R含有與抗原形成特異性相互作用的大部分殘基。 LCVR和HCVR區(qū)域內(nèi)的⑶R氨基酸殘基的編號(hào)和定位依照普遍已知的Kabat編號(hào)規(guī)則。
輕鏈被分為K或λ，其特征是本領(lǐng)域已知的特別的恒定區(qū)。重鏈被分為Y、μ、 α、δ或ε ,分別定義抗體的同種型IgG、IgM、IgA、IgD或IgE。IgG抗體可以進(jìn)一步被分為亞類，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。每條重鏈類型由具有本領(lǐng)域已知的序列的特別的恒定區(qū)表征。
如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”(Mab)指源自單拷貝或克隆，包括例如任何真核、原核或噬菌體克隆，而不限于生產(chǎn)它的方法的抗體。本發(fā)明的Mab優(yōu)選地以均質(zhì)的或基本均質(zhì)的群體存在。完整的Mab含有2條重鏈和2條輕鏈。此類單克隆抗體的“抗原結(jié)合片段”包括例如，F(xiàn)ab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段和單鏈Fv片段。可以通過(guò)例如重組技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、合成技術(shù)(例如⑶R-移植)或此類技術(shù)的組合，或本領(lǐng)域已知的其他技術(shù)，來(lái)生產(chǎn)本發(fā)明的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段。例如，可以用人CGRP或其片段免疫小鼠，可以回收和純化所獲得的抗體，并通過(guò)下列實(shí)施例中公開(kāi)的方法來(lái)評(píng)估，確定它們是否與本文公開(kāi)的抗體化合物具有相似或相同的結(jié)合和功能性質(zhì)。還可以通過(guò)常規(guī)方法制備抗原結(jié)合片段。用于生產(chǎn)和純化抗體和抗原結(jié)合片段的方法是本領(lǐng)域普遍已知的，可見(jiàn)于例如 Harlow 和 Lane(1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York,第 5-8 和 15 章，ISBN 0-87969-314-2 中。
詞組“人的工程CGRP抗體”指這樣的單克隆抗體，所述抗體經(jīng)過(guò)創(chuàng)造和/或操作而具有根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合和功能性質(zhì)，結(jié)合人CGRP，并且具有源自非人抗體的CDR周?chē)幕臼侨说幕蛲耆侨说目蚣軈^(qū)。此類人的工程抗體的“抗原結(jié)合片段”包括例如，F(xiàn)ab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段和單鏈Fv片段。“框架區(qū)”或“框架序列”指框架區(qū)I至4的任一個(gè)。本發(fā)明涵蓋的人的工程抗體及其抗原結(jié)合片段包括這樣的分子，其中，框架區(qū)I至 4的任一個(gè)或多個(gè)基本上或完全是人的，即，其中存在單個(gè)基本上或完全是人的框架區(qū)I至 4的任意可能組合。例如，這包括其中框架區(qū)I和框架區(qū)2、框架區(qū)I和框架區(qū)3、框架區(qū)I、 2和3等基本上或完全是人的分子。基本上是人的框架是與已知的人種系框架序列具有至少約80%序列同一性的那些框架。優(yōu)選地，基本上是人的框架與已知的人種系框架序列具有至少約85%、約90%、約95%或約99%序列同一性。
完全是人的框架是與已知的人種系框架序列相同的那些框架。人框架種系序列可以通過(guò)網(wǎng)址http //imgt. cines. fr獲得自ImMunoGeneTics (IMGT),或獲得自 Marie-Paule Lefranc and Gerard Lefranc,AcademicPress,2001,ISBN 012441351 的The Immunoglobulin FactsBook0 例如，種系輕鏈框架可以選自A11、A17、A18、A19、A20、A27、 A30、L1、L11、I12、L2、L5、L15、L6、L8、012、02 和 08，并且種系重鏈框架可以選自VH2_5、 VH2-26、VH2-70、VH3-20、VH3-72、VHI-46、VH3-9、VH3-66、VH3-74、VH4-31、VHI-18、VHI-69, VI-13-7、VH3-11、VH3-15、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-48、VH4-39、VH4-59 和 VH5-51。
可以使用若干種不同的方法生成除本文公開(kāi)的以外的、表現(xiàn)出類似根據(jù)本發(fā)明的功能性質(zhì)的人的工程抗體。本文公開(kāi)的特定的抗體化合物可用作模板或親代抗體化合物來(lái)制備其他的抗體化合物。在一種方法中，將親代抗體化合物CDR移植到與親代抗體化合物框架具有高度序列同一性的人框架上。一般地，新框架的序列同一性與親代抗體化合物的相應(yīng)框架的序列至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%相同。該移植可導(dǎo)致相比親代抗體的結(jié)合親和力降低。如果是此情況，可以基于Queen等人 (1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 2869公開(kāi)的具體準(zhǔn)則，在某些位置將框架回復(fù)突變?yōu)橛H代框架。描述了在人源化小鼠抗體中有用的其他參考文獻(xiàn)包括美國(guó)專利號(hào)4，816，397； 5 ，225，539 和 5，693，761 ;如 Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168 595-620 中描述的計(jì)算機(jī)程序 ABMOD 和 ENCAD ;以及 Winter 和同事的方法(Jones 等人(1986)Nature321 522-525 ； Riechmann 等人(1988) Nature 332 :323_327 ；和 Verhoeyen 等人(1988) Science 239 1534-1536。
可以如下進(jìn)行鑒定考慮用于回復(fù)突變的殘基
當(dāng)氨基酸落入下列類別時(shí)，用來(lái)自親代抗體化合物的框架(“供體框架”)的框架氨基酸取代所使用的人種系序列(“受體框架”)的框架氨基酸
(a)受體框架的人框架區(qū)中的氨基酸在所述位置對(duì)于人框架是不常見(jiàn)的，而供體免疫球蛋白中的相應(yīng)氨基酸在所述位置對(duì)于人框架是典型的；
(b)氨基酸的位置緊鄰⑶R中的一個(gè)；或
(c)在三維免疫球蛋白模型中，框架氨基酸的任何側(cè)鏈原子都在CDR氨基酸的任何原子的約5-6埃(angstrom)內(nèi)(中心至中心)。
當(dāng)受體框架的人框架區(qū)的每個(gè)氨基酸和供體框架中的相應(yīng)氨基酸在所述位置對(duì)于人框架都一般是不常見(jiàn)之時(shí)，可以用在所述位置對(duì)于人框架典型的氨基酸替代此類氨基酸。該回復(fù)突變規(guī)則使得能夠恢復(fù)親代抗體化合物的活性。
生成展示出與本文公開(kāi)的抗體化合物相似的功能特性的人的工程抗體的另一種方法涉及在不改變框架的條件下，隨機(jī)突變移植的CDR中的氨基酸，并針對(duì)與親代抗體化合物同樣好或更好的結(jié)合親和力和其他功能性質(zhì)，篩選所獲得的分子。還可以在每個(gè)CDR 中的每個(gè)氨基酸位置導(dǎo)入單個(gè)突變，再評(píng)估此類突變對(duì)于結(jié)合親和力和其他功能性質(zhì)的作用。可以組合產(chǎn)生改善性質(zhì)的單個(gè)突變，來(lái)評(píng)估彼此組合時(shí)的作用。
此外，上述兩種方法的組合也是可能的。在⑶R移植后，除了在⑶R中導(dǎo)入氨基酸改變外，可以回復(fù)突變特定的框架區(qū)。該方法學(xué)描述在Wu等人(1999) J. Mol. Biol. 294 : 151-162 中。
應(yīng)用本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用常規(guī)技術(shù)，例如定點(diǎn)誘變，來(lái)取代本文公開(kāi)的CDR和框架序列中的氨基酸，從而生成源自本發(fā)明序列的其他可變區(qū)氨基酸序列。可以在特定的取代位點(diǎn)導(dǎo)入所有的備選的天然存在的氨基酸。然后可以使用本文公開(kāi)的方法來(lái)篩選這些其他的可變區(qū)氨基酸序列，來(lái)鑒定具有指明的體內(nèi)功能的序列。通過(guò)該方法，可以鑒定適合制備根據(jù)本發(fā)明的人的工程抗體及其抗原結(jié)合部分的其他序列。優(yōu)選地，框架內(nèi)的氨基酸取代限于本文公開(kāi)的4條輕鏈和/或重鏈框架區(qū)的任何一個(gè)或多個(gè)中的1、2或3個(gè)位置。優(yōu)選地，⑶R中的氨基酸取代限于3條輕鏈和/或重鏈⑶R中的任何一個(gè)或多個(gè)中的1、2或3個(gè)位置。上述這些框架區(qū)和CDR中的多種改變的組合也是可能的。
術(shù)語(yǔ)“治療”指涉及減慢、中斷、阻遏、控制、中止、降低或逆轉(zhuǎn)癥狀、病癥、病況或疾病的進(jìn)展或嚴(yán)重程度的過(guò)程，但不必涉及完全排除與CGRP活性相關(guān)的所有的疾病相關(guān)癥狀、病況或病癥。
根據(jù)國(guó)際頭痛協(xié)會(huì)的頭痛分類委員會(huì)(Headache ClassificationCommittee of the International Headache Society (InternationalHeadache Society, 2004)),術(shù)語(yǔ) “偏頭痛”如本文所用指“無(wú)先兆的偏頭痛”(之前的“普通偏頭痛”)和“有前兆的偏頭痛”(之前的“經(jīng)典偏頭痛”)。例如，“無(wú)先兆的偏頭痛”通常的特征是具有脈沖性質(zhì)、中等或嚴(yán)重的強(qiáng)度，受常規(guī)物理活動(dòng)加劇，單側(cè)分布并與惡心、畏光和聲音恐懼相關(guān)。“有前兆的偏頭痛”可包括對(duì)視覺(jué)的干擾、對(duì)其他感覺(jué)的干擾、單側(cè)無(wú)力和在一些情況下語(yǔ)言困難。
本發(fā)明的人的工程抗體可用作人類醫(yī)藥中的藥物，通過(guò)多種途徑施用。最優(yōu)選地， 此類組合物用于腸胃外施用。可以通過(guò)本領(lǐng)域普遍已知的方法制備此類藥物組合物(參見(jiàn)例如，Remington :The Science and Practice ofPharmacy,第 19 版(1995), A. Gennaro 等人，Mack Publishing Co.),并且所述組合物包含如本文公開(kāi)的人的工程抗體和可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。
下列測(cè)定的結(jié)果證實(shí)，本發(fā)明的所示例的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段可用于治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛。
實(shí)施例I-生產(chǎn)抗體
可以如下制備和純化抗體I-V。使用最佳的預(yù)先確定的HC LC載體比例或編碼 LC(例如SEQ ID NO 27,SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :29、SEQ ID Ν0:30或SEQ ID NO :31)和 HC(例如 SEQ ID NO 32,SEQ IDNO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35 或 SEQ ID NO 36)的單個(gè)載體系統(tǒng)，使用用于分泌抗體的表達(dá)系統(tǒng)瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染恰當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞(例如HEK 293ΕΒΝΑ或CH0)。使用多種常用技術(shù)的任一種純化其中分泌了抗體的澄清的培養(yǎng)基。例如， 可以方便地將培養(yǎng)基施用于已經(jīng)用相容的緩沖液(例如磷酸緩沖鹽溶液(pH 7.4))平衡過(guò)的蛋白A或G瓊脂糖凝膠FF柱。洗滌柱子以移除非特異性結(jié)合組分。例如，通過(guò)pH梯度 (例如O. IM磷酸鈉緩沖液pH 6. 8至O. IM檸檬酸鈉緩沖液pH 3.0)洗脫結(jié)合的抗體。例如通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)抗體級(jí)分，之后混合。根據(jù)預(yù)期的用途，額外的純化是任選的。可以使用常規(guī)技術(shù)濃縮和/或無(wú)菌過(guò)濾抗體。可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)(包括尺寸排阻、疏水性相互作用、離子交換或羥基磷灰石層析)有效地移除可溶性聚合物和多聚體。在這些層析步驟后的抗體純度大于99%。產(chǎn)物可以在-70°C立即冷凍或可以凍干。這些示例性抗體的氨基酸序列提供如下。
表I-抗體 SEQ ID NO
權(quán)利要求
1.人的工程CGRP抗體，所述抗體包含輕鏈可變區(qū)(LCVR)和重鏈可變區(qū)(HCVR)，其中所述LCVR包含LCDRl、LCDR2、LCDR3氨基酸序列并且HCVR包含HCDRl、HCDR2、HCDR3氨基酸序列，其中 LCDRl 是 SEQ ID NO : 10，LCDR2 是 SEQ ID NO : 11，LCDR3 是 SEQ ID NO 5, HCDRl 是 SEQ ID NO 12, HCDR2 是 SEQ ID NO 37 并且 HCDR3 是 SEQ ID NO :38，其中人 CGRP 抗體結(jié)合人CGRP。
2.權(quán)利要求I的人的工程CGRP抗體，其中LCDRl是RASQDIDNYLN(SEQID N0:3)，LCDR2 是 YTSEYHS (SEQ ID NO 4), LCDR3 是 QQGDALPPT (SEQ ID NO 5), HCDRl 是 GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO 12)，HCDR2 是 AIYEGTCDTRYIQKFAG (SEQ ID NO 13)，并且 HCDR3 是 LSDYVSGFSY (SEQ ID NO 14)。
3.權(quán)利要求I的人的工程CGRP抗體，其中LCDRl是RASQDIDNYLN(SEQID N0:3)，LCDR2 是 YTSEYHS (SEQ ID NO 4)，LCDR3 是 QQGDALPPT (SEQ ID NO 5)，HCDRl 是 GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO 12)，HCDR2 是 AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO 15)，并且 HCDR3 是 LSDYVSGFSY (SEQ ID NO 14)。
4.權(quán)利要求I的人的工程CGRP抗體，其中LCDRl是RASKDISKYLN(SEQID N0:6)，LCDR2 是 YTSGYHS (SEQ ID NO 7)，LCDR3 是 QQGDALPPT (SEQ ID NO 5)，HCDRl 是 GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO : 12)，HCDR2 是 AIYEGTGKTVYIQKFAD (SEQ ID NO 16)，并且 HCDR3 是 LSDYVSGFGY (SEQ ID NO 39)。
5.權(quán)利要求I的人的工程CGRP抗體，其中LCDRl是RASRPIDKYLN(SEQID NO :8)，LCDR2 是 YTSEYHS (SEQ ID NO 4)，LCDR3 是 QQGDALPPT (SEQ ID NO 5), HCDRl 是 GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO 12)，HCDR2 是 AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO 15)，并且 HCDR3 是 LSDYVSGFGY (SEQ ID NO 39)。
6.權(quán)利要求I的人的工程CGRP抗體，其中LCDRl是RASQDIDKYLN(SEQID N0:9)，LCDR2 是 YTSGYHS(SEQ ID NO : 7)，LCDR3 是 QQGDALPPT (SEQ ID NO : 5)，HCDRl 是 GYTFGNYWMQ (SEQ ID NO 12)，HCDR2 是 AIYEGTGKTVYIQKFAG (SEQ ID NO 15)，并且 HCDR3 是 LSDYVSGFGY (SEQ ID NO 39)。
7.權(quán)利要求I的人的工程CGRP抗體，其中LCVR氨基酸序列是SEQID N0:42并且HCVR 氨基酸序列是SEQ ID NO 43o
8.權(quán)利要求2的人的工程CGRP抗體，其中所述LCVR氨基酸序列是SEQID NO : 17并且所述HCVR氨基酸序列是SEQ ID NO :22。
9.權(quán)利要求3的人的工程CGRP抗體，其中所述LCVR氨基酸序列是SEQID NO : 18并且所述HCVR氨基酸序列是SEQ ID NO :23。
10.權(quán)利要求4的人的工程CGRP抗體，其中所述LCVR氨基酸序列是SEQID NO : 19并且所述HCVR氨基酸序列是SEQ ID NO :24。
11.權(quán)利要求5的人的工程CGRP抗體，其中所述LCVR氨基酸序列是SEQID NO 20并且所述HCVR氨基酸序列是SEQ ID NO :25。
12.權(quán)利要求6的人的工程CGRP抗體，其中所述LCVR氨基酸序列是SEQID NO 21并且所述HCVR氨基酸序列是SEQ ID NO :26。
13.權(quán)利要求8的人的工程CGRP抗體，其中所述抗體包含輕鏈和重鏈，其中輕鏈氨基酸序列是SEQ ID NO :27并且重鏈氨基酸序列是SEQ ID NO :32。
14.權(quán)利要求9的人的工程CGRP抗體，其中所述抗體包含輕鏈和重鏈，其中輕鏈氨基酸序列是SEQ ID NO :28并且重鏈氨基酸序列是SEQ ID NO :33。
15.權(quán)利要求10的人的工程CGRP抗體，其中所述抗體包含輕鏈和重鏈，其中輕鏈氨基酸序列是SEQ ID NO :29并且重鏈氨基酸序列是SEQ ID NO :34。
16.權(quán)利要求11的人的工程CGRP抗體，其中所述抗體包含輕鏈和重鏈，其中輕鏈氨基酸序列是SEQ ID NO :30并且重鏈氨基酸序列是SEQ ID NO :35。
17.權(quán)利要求12的人的工程CGRP抗體，其中所述抗體包含輕鏈和重鏈，其中輕鏈氨基酸序列是SEQ ID NO 31并且重鏈氨基酸序列是SEQ ID NO :36。
18.權(quán)利要求13的人的工程CGRP抗體，其中所述抗體包含兩條輕鏈和兩條重鏈，其中每條輕鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO :27并且每條重鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO :32。
19.權(quán)利要求14的人的工程CGRP抗體，其中所述抗體包含兩條輕鏈和兩條重鏈，其中每條輕鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO :28并且每條重鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO :33。
20.權(quán)利要求15的人的工程CGRP抗體，其中所述抗體包含兩條輕鏈和兩條重鏈，其中每條輕鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO :29并且每條重鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO :34。
21.權(quán)利要求16的人的工程CGRP抗體，其中所述抗體包含兩條輕鏈和兩條重鏈，其中每條輕鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO :30并且每條重鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO :35。
22.權(quán)利要求17的人的工程CGRP抗體，其中所述抗體包含兩條輕鏈和兩條重鏈，其中每條輕鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO :31并且每條重鏈的氨基酸序列是SEQ ID NO :36。
23.藥物組合物，所述藥物組合物包含權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的人的工程CGRP抗體和可藥用的載體、稀釋劑或賦形劑。
24.治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛的方法，所述方法包含向有需要的人類患者施用權(quán)利要求1-22 中任一項(xiàng)的人的工程CGRP抗體。
25.如權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)所要求的人的工程CGRP抗體，其用于療法。
26.如權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的人的工程CGRP抗體，其用于治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛。
27.權(quán)利要求1-22的任一項(xiàng)的人的工程CGRP抗體在用于生產(chǎn)治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛的藥物中的用途。
28.治療偏頭痛的方法，所述方法包含向有需要的人類患者施用權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的人的工程CGRP抗體。
29.
30.用途。
31.權(quán)利要求1-22中任一項(xiàng)的人的工程CGRP抗體，其用于治療偏頭痛。權(quán)利要求1-22的任一項(xiàng)的人的工程CGRP抗體在用于生產(chǎn)治療偏頭痛的藥物中的權(quán)利要求1-22或25-28中任一項(xiàng)的人的工程CGRP抗體的抗原結(jié)合片段。
全文摘要
本發(fā)明提供了人的工程降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)抗體或其抗原結(jié)合片段。此外，本發(fā)明提供了人的工程降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的抗體或其抗原結(jié)合片段用于治療骨關(guān)節(jié)炎疼痛的用途。
文檔編號(hào)A61K39/395GK102946905SQ201180028611
公開(kāi)日2013年2月27日 申請(qǐng)日期2011年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月10日
發(fā)明者B·艾倫, R·J·本朔普, M·G·錢(qián)伯斯, R·J·達(dá)林 申請(qǐng)人:伊萊利利公司