專利名稱：酸漿苦素a提取工藝及醫藥用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫藥技術領域，涉及酸漿苦素A的提取工藝及其醫藥用途，具體涉及其在制備治療腫瘤藥物中的新用途。
背景技術：
惡性腫瘤(通稱癌癥)是當前危害人類生命健康的重要疾病之一。近20年來，在世界范圍內或中國范圍內，腫瘤的發病率與死亡率均呈上升的趨勢。據WHO統計，2008年全世界約有1270萬癌癥新增患者，死亡人數達760萬。我國2000年癌癥發病人數180-200萬，死亡140-150萬。纖維肉瘤(fibrosarcoma)是一種成纖維細胞和膠原纖維細胞形成的惡性軟組織肉瘤，曾一度被誤以為是成人軟組織肉瘤中發病率最高的一種，隨著免疫組織化學及分子診斷學等新技術的應用以及軟組織肉瘤分類的細化，最新的數據顯示纖維肉瘤在軟組織肉瘤中只占到10%(Am J Surg Pathol, 2010, 34: 1504-1513)。雖然其發病率不高，但由于其對常規化療藥物的反應 率不高，其預后也不容樂觀，易出現無法控制的全身轉移。這就需要有新藥的研究與開發應用于纖維肉瘤的治療之中。惡性黑色素瘤(melanoma)是一種惡性程度相當高的惡性腫瘤，又稱惡性黑瘤，黑色素瘤多數是在色素病變的基礎上發生，少數發生于正常皮膚或粘膜的色素細胞。具體原因不明，多數認為與內分泌因素有關。惡性黑色素瘤的發生率在皮膚癌里占不到5%，但是每年的死亡率卻是其他皮膚癌的3倍，因此對于黑色素瘤的治療越來越成為研究的熱點。黑色素瘤的早期治療主要是手術廣泛切除原發病源，由于黑色素瘤對放療不敏感，晚期不能手術的或擴散性病變采用化療聯合細胞因子和腫瘤基因疫苗等進行治療，即藥物治療聯合免疫治療(N Eng J Med，2004, 351: 998-1012)。因此藥物治療對于晚期的惡性黑色素瘤的治療起著至關重要的作用，急需有新藥的研究與開發應用于惡性黑色素瘤的治療之中。死亡受體(deathreceptors)是一類受體超家族，包括 Fas/CD95、TNFR (tumornecrosis factor receptor)、DR-3 (death receptor 3)、DR-4 和 DR-5。當相應的配體與其結合以后，其通過在胞內的死亡結構域(death domain, DD)啟動細胞內在一系列的機制，誘導細胞凋亡。其中Fas信號途徑是最具代表性的死亡受體途徑。當相應的配體與Fas受體結合后，膜上的受體就會發生二聚化，存在于胞漿中的結構域就會發生改變，之后募集細胞內的接頭蛋白FADD (Fas-associated death domain),進而使FADD的另一端死亡效應結構域(death effector domain, DED)結構發生變化,繼而募集procaspase_8,共同形成死亡誘導信號復合物(death inducing signaling complex, DISC), DISC形成后，可誘導procaspase-8自身激活,產生活性的caspase-8,活化的caspase-8則進一步激活下游的caspase-3,從而誘導凋亡(Science, 1998, 281: 1305-1308)。p53基因家族調控著多種基因的表達，在阻滯細胞周期、促進細胞凋亡、維持基因組穩定和抑制腫瘤血管生成等方面具有重要的作用。野生型p53能夠引導或促進細胞凋亡；與野生型P53相反，突變型p53則對細胞凋亡有抑制作用。p53在細胞中的半衰期很短，主要是通過轉錄后的磷酸化和乙酰化使蛋白穩定。P53可在多個位點發生磷酸化，磷酸化還可促進p53轉位到細胞核內。細胞損傷較大、不能夠被修復時，p53蛋白會促使細胞進行凋亡。Bcl-2家族中p53的靶基因主要有Bax，Noxa，PUMA和Bid。近期研究表明，p53可直接轉位到線粒體上與線粒體膜上的Bcl-xL和Bcl-2結合,增加線粒體膜通透性。此外，P53也可不通過轉錄途徑，直接促進胞漿中的Bax轉位到線粒體上，改變線粒體膜通透性。Noxa通過p53依賴和非依賴兩條通路誘導凋亡，是p53誘導細胞凋亡的下游靶基因，通過線粒體定位域定位于線粒體外膜，置換出促凋亡Bax亞家族,Bax亞家族轉位并嵌入到線粒體，使線粒體膜的通透性增強，而使線粒體內的細胞色素c釋放入胞漿，細胞色素c能與凋亡蛋白酶活化因子Apaf-1及caspase-9形成復合體,進一步激活caspase-3,啟動caspase級聯反應，誘導細胞凋亡(Science, 2003, 302: 1036-1038)。通過對腫瘤細胞的研究發現，腫瘤細胞的抗凋亡機制對腫瘤的發生及發展有著重要的意義。凋亡過程是一個細胞復雜的調控過程，其中起著至關重要作用的是半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白(cysteine aspartic specific protease, caspase),它也是多條凋亡通路的匯聚點和執行凋亡的最終途徑。正常細胞中以無活性的前體形式(procaspase)存在，當凋亡信號表達，procaspase被激活轉化為caspase,最終導致細胞凋亡。細胞的凋亡過程并不是一個簡單線性通路，其中細胞凋亡過程中的信號分子相互影響，從而構成了一個細胞凋亡的環形通路。在這個環形通路中，caspase酶家族、Bcl-2蛋白家族相互影響，Bcl-2蛋白家族能夠激活或者抑制procaspase轉化為caspase來調控細胞的凋亡,激活的caspase又能反過來影響Bcl-2家族蛋白的表達(Nature, 1998, 391: 441-442)。酸衆又名錦燈籠、燈籠草、紅姑娘、掛金燈iPhysalis alkekengi L.var.franchetii (Mast.) Makino)為爺科(solanaceace)酸衆屬植物,其干燥宿萼或帶果實的宿萼作為錦燈籠藥用(中國藥典2010版I部，337-338)。酸漿始載于《神農本草經》，其中記載“酸衆，味酸平， 主熱煩滿，定志益氣，利水道，產難，吞其實，立產”，《本草綱目》中也記載“酸漿利濕除熱，除熱故清肺止咳，利濕故能化痰治疽”。其味苦、酸，性寒，具有清熱解毒、利咽、化痰、利尿作用，在抗癌、抗炎方面有著獨特的療效(《中華本草》7冊，上海科學技術出版社，286-290)。酸漿苦素A (Physalin A)為酸漿宿萼中的主要成分之一，白色晶體，分子量526，目前對酸漿的藥理作用研究較多，但是對酸漿苦素A藥理作用機制的研究極少，僅有一篇文獻報道其對前列腺癌細胞有誘導凋亡作用(Biol Pharm Bull, 2011，34:1584-1588)，而對酸漿苦素A在其它腫瘤中的應用及具體作用機制均未見報道。對酸漿苦素A (Physalin A)這一酸漿中的主要藥效成分的提取制備工藝未見文獻報道。

發明內容
本發明首次發現了酸漿苦素A對多種腫瘤細胞有生長抑制作用，并且對正常細胞活力影響極小，優于已上市的抗腫瘤藥物紫杉醇(paclitaxel)和5_氟尿喃唳(5_Fu),小鼠急性毒性實驗表明，1.0g/kg酸漿苦素A灌胃劑量下未見毒副作用和不良反應。本發明還首次涉及了酸漿苦素A在人纖維肉瘤細胞及人黑色素瘤細胞中的作用機制，可制備用于治療腫瘤的藥物。
本發明的首要目的在于提供一種酸漿苦素A的提取工藝。本發明的另一目的在于提供酸漿苦素A在制備抗腫瘤藥物方面的新用途。
本發明所使用酸衆苦素A由本課題組從酸衆(.Physalis alkekengi L.var.franchetii (Mast.) Makino)中提取分離得到，為白色晶體(Acetone),核磁數據與文獻(Journal of Natural Product, 2008, 71:642-646)對照一致，確定其結構為酸衆苦素 A(Physalin A),純度 >98%。
權利要求
1.酸漿苦素A的提取工藝，其特征在于:以酸漿藥材為原料，通過乙醇進行回流提取，減壓回收溶劑，濃縮后得到總浸膏；總浸膏分散到水中，用等體積的乙酸乙酯萃取，萃取次數為一次或多次，萃取完成后減壓濃縮，得到乙酸乙酯層浸膏；浸膏用丙酮溶解，放置，隔夜后，丙酮溶液中有晶體產生，按照同樣方法經丙酮多次重結晶后得到酸漿苦素A。
2.根據權利要求1所述的提取工藝，其特征在于:乙醇濃度為30% 90%，料液比為10:1 70:1，每次回流提取0.5 2小時，提取次數為一次或多次。
3.根據權利要求1所述的提取工藝，其特征在于:總浸膏分散到5-10倍水中。
4.根據權利要求1所述的提取工藝，其特征在于，提取的酸漿苦素A與臨床上接受的賦形劑混合制成腸道或非腸道給藥制劑。
5.權利要求1提取的酸漿苦素A在制備抗腫瘤藥物中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述的腫瘤為人纖維肉瘤，人黑色素瘤，人肝癌，人宮頸鱗癌，人肺腺癌，人組織細胞淋巴瘤，人結腸癌，人表皮癌，人乳腺癌，人白血病。
7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于:酸漿苦素A通過激活Fas死亡受體途徑，進而激活下游caspase家族相關蛋白，誘導腫瘤細胞發生凋亡；同時，酸漿苦素A可誘導腫瘤細胞發生自噬，自噬和凋亡存在相互關系。
8.根據權利要求5所述的應用，其特征在于:酸漿苦素A通過激活p53蛋白并誘導線粒體活性氧的產生進而誘導腫瘤細胞發生凋亡，同時酸漿苦素A可激活p38蛋白誘導腫瘤細胞發生自噬，自噬和 凋亡存在相互關系。
全文摘要
本發明屬于醫藥技術領域，涉及酸漿苦素A(physalinA)提取工藝及其醫藥用途，具體涉及酸漿苦素A在制備抗腫瘤藥物中的新用途，尤其是治療人纖維肉瘤和人惡性黑色素瘤中的使用。經過工藝優化后，酸漿苦素A提取得率為0.2133%。酸漿苦素A可抑制多種腫瘤細胞生長，尤其對人纖維肉瘤和人黑色素瘤細胞生長抑制明顯，但對人正常細胞活力影響不明顯。其機制通過激活Fas死亡受體途徑，進而激活下游caspase家族相關蛋白，誘導腫瘤細胞發生凋亡；同時，酸漿苦素A可誘導腫瘤細胞發生自噬，在HT1080及A375-S2細胞中自噬拮抗凋亡；p53蛋白及MAPKs家族p38蛋白起到關鍵性調節作用。酸漿苦素A可制備消化道及非消化道給藥劑型，用于人纖維肉瘤及黑色素瘤等腫瘤的治療。
文檔編號A61P35/02GK103214497SQ20131012900
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月15日 優先權日2013年4月15日
發明者邱峰, 何昊, 池島喬, 陳麗霞, 康寧 申請人:沈陽藥科大學