專利名稱：鯉春病毒血癥抗原表位的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域。
背景技術：
我國是水產養殖大國，水產養殖總量世界第一，水產品出口量占世界第一。鯉春病毒血癥(SVC)是魚類最主要的疾病之一，以發病急、死亡率高為特征。鯉春病毒血癥病毒的宿主范圍很廣，能感染四大家魚和其他幾種鯉科魚，包括鯉魚和錦鯉、鳙魚、草魚、鰱魚、黑鯽、鯽魚、丁鱖和歐鲇等，鯉魚是其中主要的、最易感的宿主。近幾年來該病在我國大部分地區均有發生，，已成為我國淡水養殖魚類的主要病害。鯉春病毒血癥是水產動物一類傳染病，是魚類口岸檢疫的第一類檢疫對象。目前，在我國對SVC病毒的檢測方法主要是病毒分離后用RT-PCR。PCR技術雖然具有高靈敏度的優越性，但缺點是
1、結果判斷上常常會出現假陽性的情況；
2、需要專業人員和昂貴的儀器試劑；
3、不符合國際獸疫局(OIE)推薦的檢測方法。

發明內容
本發明通過噬菌體展示技術，利用鯉春病毒血癥病毒(SVCV)單克隆抗體篩選出陽性克隆，找出與SVCV單克隆抗體結合的保守序列，篩到的抗原型表位制備臨床診斷試劑， 小分子抗原肽作為疫苗防治鯉春病毒血癥。本發明基因序列是SEQ ID NO :1。本發明鯉春病毒血癥抗原表位在制備鯉春病毒血癥疫苗的應用。本發明利用噬菌體展示技術，通過SVCV單克隆抗體篩選陽性克隆，找出在隨機肽庫中能與中和SVCV活性的單克隆抗體結合的保守序列。確定該抗原決定簇的位點，分析其序列，結構與功能的關系；研究小肽競爭與SVCV受體結合，針對SVCV而產生抑制作用，對未來小分子抗原肽作為疫苗，將具有巨大的應用價值。


圖1是本發明第1、2輪篩選6次洗脫擴增的噬菌體克隆點雜交結果； 圖2是本發明第3輪篩選3次洗脫擴增的陽性克隆點雜交結果；
圖3是本發明短膚觸合蛋白組的設計表達與純化；
圖4是本發明抗原表位在ELISA和Westernblot的結果中，均被免疫血清所識別； 圖5是本發明短肽融合蛋白與細胞結合活性測定； 圖6是本發明加入抗血清后短肽蛋白與細胞結合活性測定； 圖7是本發明陽性雜交瘤細胞染色體形態； 圖8是本發明2A3抗體與不同濃度抗原結合的ELISA曲線圖；圖9是本發明3H7抗體與不同濃度抗原結合的ELISA曲線圖； 圖10是本發明SVXV單克隆抗體正辛酸純化的SDS-PAGE電泳結果； 圖11是本發明2株腹水與抗原的反應結果。
具體實施例方式本發明鯉春病毒血癥抗原表位基因序列是SEQ ID NO :1。本發明鯉春病毒血癥抗原表位在制備鯉春病毒血癥疫苗的應用。一、鯉春病毒血癥病毒(SVCV)單克隆抗體制備 1材料與方法
1. 1材料 1. 1. 1主要試劑
弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑和二氨基聯苯胺(DAB)以及青霉素G (鈉鹽)和鏈霉素(硫酸鹽)購自北京鼎國生物技術公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG購自北京中山生物技術公司；RPMI-1640培養基、100倍HT和100倍HAT、HEPES、二甲基亞砜(DMS0)、 聚乙二醇4000、秋水仙素、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、十二烷基硫酸鈉(SDS)、過硫酸銨、 PNA, β-巰基乙醇和硝酸纖維素膜購自Sigma公司；抗體亞類鑒定試劑(IgGl、IgG2a, IgG2b、IgG3、IgM、IgA)購自 Pharmacia 公司；低分子量標準蛋白(97. 4,66. 2,43. 0,31. 0、 20. 1和14. 4kD)購自TaKaRa公司；胎牛血清購自HyClone公司；其它試劑均為進口分裝或國產分析純化學試劑。1. 1. 2鯉春病毒血癥病毒鯉春病毒血癥病毒本實驗室保存 1. 1.3實驗動物
BALB/c小鼠購自長春生物制品研究所實驗動物中心。1.1.4 細胞株
SP2/0骨髓瘤細胞為軍事醫學科學院十一所細菌室保存。EPC購自中科院上海細胞所 1. 1. 5主要培養液及緩沖液
青、鏈霉素(雙抗)溶液取青霉素G (鈉鹽)100萬U和鏈霉素(硫酸鹽)lg，溶于IOOml 去離子水中，過濾除菌，分裝小瓶，-20°C保存備用。50%聚乙二醇取PEG 0. 5g于0. 5ml去離子水中，121°C高壓滅菌15min備用。RPMI-1640培養液取商品化RPMI-1640培養基粉劑按說明書配制，充分溶解后每 IOOOml加HEPES 2g，青、鏈霉素(雙抗)溶液1ml，用HCl或NaOH調pH值為7. 2，過濾除菌， 分裝后_20°C保存備用。20%胎牛血清RPMI-1640培養液RPMI_1640培養液80ml加胎牛血清20ml。HAT選擇培養液RPMI-1640培養液80ml，加100倍HAT 1. 0ml，胎牛血清20ml。HT選擇培養液RPMI-1640培養液80ml，加100倍HT 1. 0ml，胎牛血清20ml。細胞凍存液90ml胎牛血清加IOml 二甲基亞砜，_20°C保存備用。0. 2%臺盼藍溶液0. 2g臺盼藍溶于100ml PBS中。抗原包被液(pH7.6) =NaCO3 1. 59g，NaHCO3 2. 93g，溶于 1000ml 蒸餾水中。PBS (pH7. 4) =NaCl 8. 0g, Na2HPO4 12H20 2. 9g, KCl 0. 2g，溶于 1000ml 蒸餾水。
封閉液3%BSA，用 pH7. 4 的 PBS 配制。抗體稀釋液0. 3% BSA，用pH7. 4的PBS配制。洗滌液100ml PBS 中力口 0. Iml Tween—20。底物溶液(OPD-H2A溶液):4mg OPD溶于IOml pH5. 0的磷酸鹽一檸檬酸緩沖液中， 力口 30% H2O2 15 μ 1。1. 1. 6主要儀器
二氧化碳培養箱、-70 V超低溫冰箱(SANYO公司產品)，倒置顯微鏡()(DS-1B，重慶光電儀器總公司產品)，96孔酶標板、96孔及M孔細胞培養板(NUNC公司產品)，超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司產品)，酶聯免疫檢測儀(ELX800，Bio-TEK公司產品)，垂直板電泳儀(槽) (BI0-RAD公司產品)，轉移電泳槽(北京六一儀器廠產品)，其它儀器為國產普通小型儀器。1. 2 方法 1.2. 1動物免疫
培養鯉魚上皮瘤細胞(EPC)，傳代M 48 h之后接種SVCV。當細胞產生90%病變之后反復凍融3次，收集病毒液。將病毒液以4°C 8 000 r/min離心1 h，取上清以 12°C 35000 r/min超速離心3 h,取沉淀溶于適量PBS中，將部分樣品加于濃度為30% 蔗糖界面上，45 000 r/min離心5 h,收獲沉淀溶于PBS中，以40 000 r/min離心
3 h去除蔗糖，沉淀溶于少量PBS中。按同樣的方法處理正常的EPC作為對照。用純化的SVCV抗原免疫8周齡BALB/c小鼠，免疫3次，每次間隔2周。初次免疫時抗原加等量弗氏完全佐劑，后2次加等量弗氏不完全佐劑，免疫劑量均為100 Lg/只，免疫途徑為頸背部多點皮下注射；融合前3天做加強免疫，用不加佐劑抗原腹腔注射，100 Lg/只。1.2.2小鼠腹腔巨噬細胞制備飼養細胞
取一只沒有免疫的健康BALB/c小鼠，拉頸處死，浸入75%的酒精中消毒lOmin，移入超凈臺，用無菌手術剪剪開腹部皮膚，暴露腹膜，用玻璃注射器注入腹腔IOml RPMI-1640培養液，按摩腹部，用注射器吸取培養液，然后用5mlRPMI-1640培養液重復一次，合并兩次吸出的液體，滴入3塊96孔培養板，每孔50 μ 1，37°C 5%C02培養箱培養12 24h備用。1. 2. 3骨髓瘤細胞懸液的制備
在細胞融合前Mh，給預先培養的骨髓瘤細胞換液一次，使其處于對數生長期，融合前從培養瓶移出骨髓瘤細胞于滅菌的離心管，用IOml RPMI-1640培養液洗滌3次(lOOOrpm， 5min),用RPMI-1640培養液重懸細胞，對細胞懸液計數，調整細胞數為1 X IO5飛X IO5個/ ml ο1.2.4免疫脾細胞懸液的制備
在最后一次免疫注射后第3d，取免疫的小鼠，摘除眼球放血，收集血液分離血清，供檢測抗體和作實驗的陽性對照用。小鼠拉頸處死，用自來水沖洗后浸入75%酒精中消毒 lOmin，隨即放入超凈臺內，用無菌剪刀剪開小鼠腹腔，取出脾臟，放入玻璃培皿中的消毒銅網上，滴入2ml無血清RPMI-1640培養液，用5ml注射器針筒芯研磨脾臟，使之成漿狀，用鑷子夾住銅網，滴加適量無血清RPMI-1640培養液洗滌，將培養皿靜置3 5min，待大的組織塊沉淀后，小心吸取細胞懸液，移入50ml塑料離心管內，用RPMI-1640培養液洗滌細胞2次 (lOOOrpm, lOmin)，用RPMI-1640培養液重新懸浮細胞并計數，調整細胞數為1 X IO8個/ml。
1. 2. 5細胞融合
將已制備好的骨髓瘤細胞與脾細胞混合于50ml離心管內，脾細胞與骨髓瘤細胞之比為10:1，用RPMI-1640培養液洗滌細胞2次(1200rpm，lOmin)，同時將50%PEG和IOml RPMI-1640培養液于37°C水浴預熱。最后一次洗滌后棄去上清液，用力振動離心管，振散細胞團塊，置于37°C水浴中。在Imin內滴加0. 5ml 50%PEG，緩慢振蕩，加完后靜置90s，在 Imin內滴加細1無血清RPMI-1640培養液，在!Bmin內加Iml無血清RPMI-1640培養液，補加至30ml，靜置lOmin，IOOOrpm離心lOmin，棄去上清液，輕輕振散細胞團塊，加入15ml含 20%小牛血清的HAT RPMI-1640培養液，制成細胞懸液。加入含有飼養細胞的96孔細胞培養板中，每孔0. 1ml，于37°C 5%C02培養箱培養。融合后每天觀察細胞生長情況，于第4、6、8、 IOd每孔吸去50 μ 1培養液上清，加入50 μ 1 HAT培養液，第Ild改換同量的HT RPMI-1640 培養液。1.2.6雜交瘤抗體檢測
鯉春病毒血癥病毒抗原用包被緩沖液50倍稀釋，滴加入3塊96孔酶標板，每孔 100 μ 1，置4°C冰箱過夜，次日甩干包被液，每孔加入IOOul封閉液，置37°C溫箱中孵育4h， 取出后甩干封閉液，洗滌液洗滌3次，每次:3min。將融合細胞培養上清加入封閉過的酶標板中，其中兩孔加入SP2/0培養上清作為陰性對照，另外兩孔加入抗血清作為陽性對照，置 37°C溫箱中孵育lh，取出后洗滌液洗滌3次，每次;3min。洗滌后于酶標板每孔中加入1 5000倍稀釋的酶標二抗100 μ 1，置37°C溫箱中孵育lh，取出后洗滌液洗滌3次，每次3min。 加入底物溶液，每孔ΙΟΟμ 1，置37°C溫箱中孵育20min顯色，取出后每孔加入50μ 1終止液，終止顯色反應。于酶標儀上測定各孔OD49tlnm值。被測孔OD49tlnm值大于陰性2倍以判定為陽性。1.2.7陽性雜交瘤細胞克隆化
將經ELISA檢測為陽性的雜交瘤細胞吹打成細胞懸液，進行細胞計數，然后按照1個 /孔的稀釋度稀釋細胞懸液，加入含飼養細胞的96孔細胞培養板培養。對有細胞克隆生長的培養孔，待其生長至一個視野的1/2以上時即可按1. 2. 6雜交瘤抗體檢測的方法進行檢測。檢測獲得的陽性孔再次按同樣的方法進行克隆、檢測，直至所有克隆化的細胞全部都為陽性，挑選生長良好且陽性較強的細胞孔，將細胞吹打下來，移入M孔板擴大培養，培養換液時收集培養液上清，部分凍存，部分備用。1.2.8陽性雜交瘤細胞克隆株的凍存
將M孔板中擴大培養的細胞株，進一步在5ml、10ml、50ml培養瓶中逐步擴大培養，除一部分用于腹水的制備之外，其余細胞在對數生長期時，收集細胞懸液，離心后傾去上清， 加入含10% 二甲基亞砜的小牛血清，混均后移入細胞凍存管內，-70°C冰箱中過夜，次日放入液氮罐中保存。1. 2. 9腹水的制備
取成年BALB/c雌性小鼠，腹腔注射0. 5ml石蠟油，一周后取處在對數生長期的陽性雜交瘤細胞株，倒掉培養上清，用無血清RPMI-1640培養液懸浮細胞，細胞計數，調整細胞數為6X105/ml。將其注入經石蠟油處理過的小鼠腹腔內，每只注入0.5ml。待小鼠腹腔明顯脹大后，采集腹水，Id后再采集一次。收集到的腹水置37°C溫箱ai，4000rpm離心lOmin，吸取上清液，56°C水浴滅活30min后，置_20°C冰箱冰存備用。
1. 2. 10陽性雜交瘤細胞染色體測定
取對數生長期雜交瘤細胞用終濃度為0. 25umol/L秋水仙素處理4 h，收集細胞后用低滲KCl溶液處理15min，固定液固定，吸管滴加細胞懸液到4°C預冷的載波片上，載波片室溫下自然干燥，吉姆薩染色，顯微鏡下觀察并照相，統計染色體數目。1.2.11雜交瘤細胞株分泌單克隆抗體的穩定性測定
將亞克隆陽性率達100%的細胞株體外連續培養2個月，每隔一周取細胞培養上清液檢測抗體效價；將凍存6個月后的細胞株復蘇，取培養上清液檢測抗體效價。1. 2. 12單克隆抗體ELISA最佳反應濃度的測定
采用間接ELISA方陣檢測。將鯉春病毒血癥病毒抗原倍比稀釋縱向包被酶標板，3%牛血清白蛋白封閉lh，洗滌3遍。抗體倍比稀釋橫向包被酶標板，37°C溫箱孵育lh，洗滌3遍。 加入HRP-羊抗鼠IgG酶標二抗，37°C溫箱孵育lh，洗滌3遍，顯色后測定各孔OD49tlnm值，確定單克隆抗體最佳反應濃度。1. 2. 13單克隆抗體亞類鑒定
采用間接ELISA法。純化的每株單克隆抗體1000倍稀釋后包被酶標板，每孔100 μ 1， 37°C孵育lh，洗滌后每孔加入1000倍稀釋的抗體亞類試劑100μ 1，37°C孵育lh，洗滌3遍。 然后加入HRP-羊抗鼠IgG酶標二抗，37°C孵育lh，洗滌后加入底物顯色，確定各株單克隆抗體的亞類。1. 2. 14單克隆抗體親和力測定[139]
采用非競爭酶免疫實驗。純化的每株單克隆抗體，經紫外分光光度計^Onm測定其起始濃度，以不同抗原濃度進行抗體倍比稀釋的間接ELISA檢測，繪制反應曲線，以曲線上最大OD49tlnm值一半時的抗體濃度計算單克隆抗體的親和力常數，確定抗體與抗原的結合能力。 抗體親和力常數以如下公式計算。
權利要求
1.一種鯉春病毒血癥抗原表位，其特征在于基因序列是SEQ ID NO :1。
2.權利要求1所述的鯉春病毒血癥抗原表位在制備鯉春病毒血癥疫苗的應用。
全文摘要
一種鯉春病毒血癥抗原表位，屬于生物技術領域。本發明通過噬菌體展示技術，利用鯉春病毒血癥病毒(SVCV)單克隆抗體篩選出陽性克隆，找出與SVCV單克隆抗體結合的保守序列，篩到的抗原型表位制備臨床診斷試劑，小分子抗原肽作為疫苗防治鯉春病毒血癥。 本發明基因序列是SEQ　ID　NO1。本發明利用噬菌體展示技術，通過SVCV單克隆抗體篩選陽性克隆，找出在隨機肽庫中能與中和SVCV活性的單克隆抗體結合的保守序列。確定該抗原決定簇的位點，分析其序列，結構與功能的關系；研究小肽競爭與SVCV受體結合，針對SVCV而產生抑制作用，對未來小分子抗原肽作為疫苗，將具有巨大的應用價值。
文檔編號A61P31/14GK102399263SQ20101028019
公開日2012年4月4日 申請日期2010年9月14日 優先權日2010年9月14日
發明者張培軍, 張林波, 李月紅 申請人:李月紅