專利名稱：用于輪狀病毒感染的輪狀病毒屬抗原、疫苗和診斷試劑以及用于產生抗原的方法
技術領域：
本發明涉及輪狀病毒抗原(這種抗原很難通過細胞培養大量產生)、用于輪狀病毒感染的疫苗、用于診斷疾病的試劑和產生上述物質的方法。更具體地說，本發明涉及一種對輪狀病毒感染的預防和診斷有用且使用輪狀病毒抗原作為有效成分的疫苗和診斷試劑。特別是本發明對人類輪狀病毒感染的預防與診斷有很大貢獻。
背景技術：
輪狀病毒是一種能引起人類、猴子、狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、兔、大鼠、雞、火雞等腹瀉的病原微生物，這種病毒廣泛分布于世界各地。在人類中，輪狀病毒感染特別引起人們的注意，如嬰兒嘔吐和腹瀉、嬰兒冬季腹瀉、腹瀉且糞便白色、兒童假霍亂等等。世界各地已經非常重視對輪狀病毒感染的預防和診斷。
下面將要敘述的內容與輪狀病毒相關。形態學特征和基因組結構按照病毒分類學國際委員會第6次報告，此病毒屬于呼吸道腸道病毒科，其為直徑大約為70nm的精確二十面體，其包括內殼和外殼的雙層殼結構(總共三層，包括中間層)，而且沒有被膜，而且輪狀病毒在內殼的中心有一個直徑大約為50nm的核。在核的內部有一條染色體組，這條染色體組包含具有11個片段的線性雙鏈RNA，并且這些染色體組片段的長度在0.6-3.3kbp之間(“病毒分類學病毒分類學國際委員會第6次報告”，病毒學檔案，增刊10,pp.219-222,1995)。基因型和血清型從產生疫苗和診斷試劑的角度來看，在上述的11個染色體組片段中，人們特別關注第四條染色體組片段和第九條染色體組片段(相當于一些毒株的第七條或第八條染色體組片段)。在世界范圍內，分離的輪狀病毒毒株已經分為A-F6個組(血清組)，每個組分成各種血清型；另外，為了方便，按照基因型將輪狀病毒毒株概括性地分組。這些分離的毒株具有各種各樣的抗原性和基因型(＂病毒學領域＂，第3版，vol.12,pp.1625-1629,B.N.Fields等編輯，tippincott-Raven出版社，1996，美國)。下面描述的是關于以上所提到的這些方面。
第四條染色體組片段編碼暴露在病毒粒子表面刺突中的結構蛋白VP4，據報道或推測VP4在功能上可能與血細胞凝集素、中和抗原、蛋白酶促進的傳染性、致病性、膜融合、細胞的吸附等有關。在VP4的氨基酸序列以及基因的RNA或cDNA同源性的基礎上，目前將輪狀病毒毒株分成20種基因型(＂在下文稱作“P基因型”)；在中和試驗的基礎上，將輪狀病毒毒株也分成10或14個血清型(下文稱為“血清型P”)。
第九條染色體組片段(在一些毒株中為第七條或第八條染色體組片段)編碼病毒粒子的外殼VP7，據報道或推測VP7在功能上可能保持中和抗原的表位和兩個疏水區。在VP7的中和試驗基礎上，將輪狀病毒毒株分為14個血清型(下文稱作“血清型G”)。輪狀病毒毒株的分類在目前報道(＂病毒學領域＂，第3版，vol.2,p.1627)的許多各種分離的毒株中，將A組的典型人輪狀病毒毒株和由本發明人分離并報道的菌株(即AU-1(臨床微生物學雜志，25,1159-1164,1987)、AU32(微生物學和免疫學，34,77-82,1990)和AU64(病毒學檔案，19,67-81,1991))概括性地分為表1所示的幾類。
表1毒株名稱血清型G和P[基因型]Wa G1P1A[8]DS-1G2P1B[4]P G3P1A[8]AU-1G3P3[9]HochiG4P1A[8]ST3G4P2A[6]AU32G9P1A[8]AU64G1P1B[4]血清型的檢測頻率按照世界范圍的大約20個關于輪狀病毒的血清型G的檢測頻率研究報告，G1型是主要的，在日本、歐洲國家、澳大利亞和中非等國中占大約60-85％，而余下的主要是G2型和G3型。另外，在印度、泰國、孟加拉國、墨西哥等國發現G1、G2、G3和G4有零星分布，它們占總量的比例大約為20-80％，同時，也明顯地觀察到零星存在這些病毒以外的其它類型。病毒培養因為從猴子和牛中分離的輪狀病毒一般生長在相對容易得到的培養細胞中，所以這種輪狀病毒的培養和傳代不是特別的困難。然而，通過細胞培養進行人輪狀病毒傳代的過程中會發生所謂的失敗的感染，其特征包括產生了用于獲得感染性的病毒粒子的不可能連續傳代的病毒抗原。因此，病毒傳代是非常困難的。因而設計了一種方法，這種方法包括制備介于具有低生長潛力的人輪狀病毒和具有高生長潛力的來源于猴子或牛的輪狀病毒之間的重排列病毒，以改進人輪狀病毒的生長潛力；或者這種方法包括把用胰蛋白酶預先處理的人輪狀病毒接種到猴子的細胞株MA104(ECACC 85102918)和AGMK(非洲綠猴腎)細胞中，其后將輪狀病毒注射到滾管培養物中，所說的培養物使用了保持培養基(添加了胰蛋白酶，并進行了混合)。目前，幾乎所有的A組的人輪狀病毒都可以直接培養或者從實驗室中分離出來。然而，即使是通過上述滾管培養，也不能回收能夠引起產生疫苗或者診斷試劑量的病毒抗原。而且，就目前來說，培養或傳代除了A組病毒之外的輪狀病毒還是非常困難的。病毒培養的宿主為了培養能使輪狀病毒增殖的細胞，已知的有下列各種不同于MA104和GMK細胞的單個細胞株FBK(胎牛腎)、CMK(獼猴腎)、MK(食蟹短尾猴腎)等的單個細胞；來源于猴子的CV-1、FRh L2、BSC-1和Vero細胞的單個細胞株；來源于狗的MDCK和來源于人小腸表皮的CaCO-2等(WO92/01784，日本公開專利06-328107、“病毒學領域”，第三版，vol.2,pp.1647-1648,pp.1661-1162)。為了大量生產輪狀病毒抗原以便產生疫苗，可以使用下列細胞株以產生其它的病毒疫苗，例如Vero、DBS-FLC-1、DBS-FLC-2、DBS-FRh L2、ESK-4、HEL、IMR-90、MRC-5、MRC-9、WI-38和WRL68(“在保護時間范圍內的ATCC微生物和細胞”，第二版，p.144，美國典型培養物保藏中心1991，美國)疫苗大約從1985年開始，人們就試圖產生抗人輪狀病毒感染的疫苗。其主流在于通過所謂的Jennerian方法產生活體疫苗，其中使用了具有相似抗原性的非人類來源的減毒疫苗(如天花疫苗)用作替代疫苗；例如，已知通過使用來源于牛或猴的減毒疫苗或者介于兩種病毒毒株(每種來源于人和牛、人和猴)的減毒重排列病毒進行活體疫苗臨床實驗(WO92/01784；EPO130906；日本專利公開06-328107；“現代疫苗學”，pp.213-229,E.Kurstak編輯，Plenum醫藥圖書公司1994，美國；＂疫苗＂，第二版，pp.809-822,S.A.Plotolokin和E.A.Mortimer編輯，W.B.Saundors公司1994，美國；“約旦報告-加速開發的1996年疫苗”，p.46和p.68，美國國家健康研究所，美國)。已經積累了這些活體疫苗的臨床試驗或它的口服劑量的數據，然而，人們還注意到它的預防效果是不令人滿意的。因此，目前人們努力通過與Jennerian方法不同的方法來產生疫苗。診斷試劑目前主要使用多克隆或者單克隆抗體來檢測抗原，例如，可以從市場上買到EIA(酶免疫測定)、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、乳汁凝集和無源血細胞凝集的試劑盒。現在PAGE-SS(使用銀染色的聚丙烯酰胺凝膠電泳)、PCR(聚合酶鏈反應)等作為基因水平的診斷方法(“感染性疾病的原理和實踐”，第4版，vol.2,pp.1450-1451,G.L.Mandell等編輯，ChurchillLivingstone1995，美國)。因為在抗體的檢測中還沒有使用病毒抗原作為診斷試劑，所以在患者中各種抗輪狀病毒抗原的抗體隨時間變化的相關數據還可能不太充分，盡管這些數據對說明輪狀病毒感染和其預防和治療手段來說是特別有用的。
在這種情況下，本發明得到了上面所述的人輪狀病毒。本發明的一個目標是改觀目前通過細胞培養大量產生輪狀病毒抗原較困難的狀態；提供大規模產生輪狀病毒抗原(即產生抗輪狀病毒感染的疫苗所需的抗原)的方法；以及產生這些疾病的診斷試劑的方法。
本發明的另一個目的是提供通過上述方法回收的抗原，并通過使用這種抗原提供抗輪狀病毒感染的疫苗和這種疾病的診斷試劑。
本發明的公開內容為了解決這些問題，本申請提供了下列的發明。
更具體地說，本發明的第一部分是產生輪狀病毒抗原的方法，這種方法包括從細胞培養物中克隆出高度允許輪狀病毒增殖的細胞；通過在產生的克隆細胞株中傳代輪狀病毒和使輪狀病毒適應克隆的細胞株來制備一種適應克隆細胞的病毒毒株；培養適應的輪狀病毒毒株或者通過使用適應的輪狀病毒毒株作為親本毒株制備的重排列病毒作為種子病毒；和從種子病毒的培養基中分離和純化輪狀病毒抗原。
在本發明第一部分優選的實施方案中，培養細胞是Vero細胞(ATCCCCL81)。
在本發明第一部分的另一個優選的實施方案中，克隆細胞株是VeroCL-9(FERM BP-6028)。
在本發明第一部分的另一個優選的實施方案中，輪狀病毒是人輪狀病毒株AU32n和/或AU64n。
本發明的第二部分是通過上面提及的方法回收輪狀病毒抗原。
本發明的第三部分是通過使用一種滅活劑滅活本發明第二部分的輪狀病毒抗原來制備的滅活的抗原。
本發明的第四部分是抗輪狀病毒感染的疫苗，這種疫苗含有能引起免疫應答量的本發明的第二部分的輪狀病毒抗原或者本發明的第三部分的滅活的抗原。
本發明的第五部分是抗輪狀病毒感染的組合多價疫苗，這種疫苗含有能引起免疫應答量的兩種或多種抗原，其中所說的抗原是本發明的第二部分的輪狀病毒抗原或者本發明的第三部分的滅活的抗原，并且這些抗原的血清型或者基因型互不相同。
本發明的第六部分是一種診斷試劑，這種試劑中含有能引起抗原-抗體反應量的第二部分的輪狀病毒抗原或者第三部分的滅活的抗原。
本發明的第七部分是克隆的細胞株Vero C1-9(FERM BP-6028 )。
本發明的第八部分是適應克隆細胞的人輪狀病毒毒株AU32n。
本發明的第九部分是適應克隆細胞的人輪狀病毒毒株AU64n。
在本申請中，術語“克隆的細胞株”是指由單細胞(種類)的子代單獨組成的克隆的培養細胞。
術語“適應”是指促進突變或選擇病毒增殖能力以適應增殖力，使之在病毒培養時，可以在細胞類型和溫度不變的條件下大量產生病毒。例如，適應了某種細胞的病毒可以在細胞中很好地增殖，適應了低溫的病毒在低溫下可能很好地增殖。
術語“允許”是指細胞允許病毒增殖的“允許”屬性。例如，術語“允許輪狀病毒細胞”是指輪狀病毒在所說的細胞中增殖或可以在細胞中培養輪狀病毒。
術語“適應克隆細胞的病毒毒株”是指通過病毒在克隆細胞株中的連續傳代適應了克隆細胞株的病毒。
在下面的描述中，將以實施本發明最好的方式詳盡地說明其它術語。實施本發明的最佳方式通過進行下面的第一至第四步，可以實現本申請的每個發明。
第一步通過細胞培養克隆高度允許輪狀病毒增殖的細胞，即高度允許的細胞。
第二步在克隆細胞株中進行病毒連續的傳代的條件下，制備適應于上述的步驟中回收的克隆細胞株的適應克隆細胞的輪狀病毒毒株，也就是說在克隆細胞株中具有特別高的活性或能夠高度增殖的適應的輪狀病毒毒株。如果需要，使用適應的輪狀病毒毒株作為親本毒株制備重排列病毒。在第一步中使用的輪狀病毒不必與在第二步中培養的輪狀病毒相同。
第三步通過培養在前面步驟中得到的適應毒株或重排列病毒作為子病毒，大量產生輪狀病毒抗原，即完全的輪狀病毒粒子、不完全輪狀病毒粒子、抗原蛋白質、基因組、基因等。
第四步通過純化、加工、或修飾前面步驟中得到的完全的輪狀病毒粒子、不完全輪狀病毒粒子、抗原蛋白質、基因組、基因等制備和產生疫苗、診斷試劑以及試劑等。
下面依次描述了這些過程。在第一步使用的培養細胞使用在前面的背景技術部分“病毒培養宿主”所述的各種細胞或者細胞株作為用于克隆高度允許輪狀病毒增殖的細胞的目標培養細胞。然后，使用缺少反向污染因子或癌基因的培養細胞，例如，優選地使用Vero細胞(ATCC CCL81)。用于第二步的輪狀病毒使用在參考文獻(“病毒學領域”，第三版，vol.2,p.1627，病毒學檔案，19,67-81,1991，等)中描述的分離毒株或合適的輪狀病毒毒株作為傳代到并適應上述步驟中回收的克隆細胞株的輪狀病毒。特別優選的是在細胞培養期間很難傳代的毒株或希望增加抗原的產生的毒株。例如，已知毒株AU-1、AU32、AU64和在產生疫苗中作為病毒毒株并且具有合適的傳代史的新型人輪狀病毒毒株(例如本發明提供的AU32n和AU64n)是優選的。細胞培養基和用于病毒生長的培養基可以使用已知的和市售的培養基，例如199培養基、MEM(Eagle的基本必需培養基)、BME(Eagle的基礎培養基)、Hanks溶液和Dulbecco磷酸鹽緩沖的鹽溶液(PBS)。在一般的有關病毒實驗、細胞培養、組織培養的文章(例如“細胞和組織培養；實驗室方法”，共二卷，Doyle等編輯，JohnWiley和Sons1993，美國)和產品目錄中詳細描述了這些培養基的組成和制備方法。可以將輔助試劑或添加劑加入到這些培養基或鹽溶液中。可以使用常規的物質作為添加劑；例如，可以從市售人血清、胎牛血清、抗體、碳酸氫鈉、氯化鈉、非必需氨基酸等中選擇，并以合適的量加入。例如加入的添加劑的最終濃度(與1升培養基混合)如下血清大約3-25％(V/V)；碳酸氫鈉大約1-6g；氯化鈉大約為0.1-0.15摩爾；非必需氨基酸的量為產品目錄中描述的標準量。已知將蛋白酶或者胰蛋白酶加入并混合到輪狀病毒增殖培養基中是優選的。本發明中的用于輪狀病毒生長的培養基中，胰蛋白酶最終濃度為大約0.1-10μg/ml。細胞培養和細胞克隆細胞株的傳代一般包括在細胞培養基中制備濃度大約為1×105-4×105細胞/ml的細胞懸浮液；傳代大約為培養容器的1/10-1/5體積(例如在100ml容器中大約10-20ml)的懸浮液；然后在大約37℃下培養細胞。一般使用大約最終濃度為0.25％(W/V)的胰蛋白酶溶液(預先在已經除去了Ca和Mg離子的PBS中制備)從培養容器表面區域的底部剝去形成的單層細胞，然后分散細胞。
按照常規方法(上述的“細胞和組織培養；實驗室方法”，vol.1,pp.4B:3)克隆細胞。例如通過制備只由單個細胞子代構成的克隆的方法(集落形成方法)可以很好地完成細胞克隆，所說的方法包括在胰蛋白酶溶液中剝去單層的培養細胞，并且將細胞層分散在細胞培養基中以制備游離細胞的懸浮液(大約1-5個細胞/ml)，然后將懸浮液接種到培養容器(例如，培養皿或者微量試驗平板)中培養。分別培養得到的集落以增加細胞數量，因此得到了克隆細胞或克隆細胞株。病毒培養、傳代和適應在細胞培養的宿主中進行病毒培養的溫度一般為大約20-37℃，培養時間為大約2-16天。可以使用靜止培養或滾管培養。在培養后將培養的上清液進行病毒傳代以得到病毒懸浮液。通過依次在新鮮培養細胞中接種病毒懸浮液以使病毒增殖。通過在特異性的細胞中重復進行病毒的傳代，大約2-50次，優選的為3-20次，這樣就得到了在細胞中高度增殖的適應特異性細胞的病毒毒株。通過制備介于適應的病毒毒株(作為親本毒株)和另一種病毒毒株之間的重排列病毒，可以將適應的病毒的高增殖力轉移到不同的病毒毒株中。將用紫外線(UV)輻射滅活的輪狀病毒毒株和適應的病毒毒株混合并培養混合物，由此誘導兩種毒株的病毒染色體組片段重新組配；用抗親本毒株中和抗體除去親本毒株病毒，就得到了作為重排列病毒余下的感染病毒。輪狀病毒的高度允許克隆細胞株的選擇通過在每一種克隆細胞中接種和培養輪狀病毒，測定了通過病毒增殖產生的感染性病毒和病毒粒子的數量或病毒抗原的水平。此時，由于在MOI(感染復數)方面的差異，通過下面的方法測定增殖的程度(即所謂的病毒產生水平、高或低，其取決于病毒的接種水平的差異)是重要的。通過使用測量值作為標志篩選使得病毒能夠高度增殖的細胞，可以產生高度允許的克隆細胞株。通過噬斑形成方法(計數PFU(噬斑形成單位))、病灶形成方法(計數FFU(病灶形成單位))、ELISA、IME(免疫電子顯微術)等方法進行測量。在本發明中，通過熒光抗體技術進行FFU計數，這種技術包括通過EIA(酶免疫測定)等用熒光染料FITC(異硫氰酸熒光素)標記的抗體對由于病毒感染和增殖而形成的感染細胞區域進行染色。病毒和抗原的大量產生和制備通過使用高度允許克隆細胞株的細胞培養物作為宿主細胞和培養適應細胞株的病毒毒株，大規模生產病毒和抗原。更具體地說，在培養結束后在低速離心后收集病毒培養液上清液(例如，在干冰及有機溶液中冷凍和解凍的病毒感染細胞懸浮液的上清液)以制備完全病毒粒子和抗原。這種制劑可以作為病毒懸浮液使用。所說的懸浮液可以通過膜過濾消毒，或也可以將抗體加入到懸浮液中。可以通過膜濃縮、密度梯度超速離心、在蔗糖墊層上的超速離心等將懸浮液中的病毒抗原等濃縮和純化。將病毒懸浮液放置到蔗糖溶液(作為墊層)上，例如，其后進行超速離心并在離心管底部沉淀出病毒抗原，將沉淀物再一次懸浮以制備純化的病毒抗原。疫苗批量溶液的制備可以通過使用病毒懸浮液或純化的病毒抗原制備疫苗的批量溶液。可以使用病毒懸浮液中的完全病毒粒子、不完全病毒粒子、毒粒結構蛋白(例如VP4和VP7)、中和反應表位、翻譯后修飾的結構蛋白等以及非毒粒結構蛋白和翻譯后修飾蛋白、抗感染的保護性抗原等作為疫苗的抗原。可以使用滅活劑固定這種疫苗的抗原，以便穩定立體結構。例如，可以使用福爾馬林、苯酚、戊二醛、β-丙醇酸內酯等滅活劑，將滅活劑在制備溶液之前或之后加入疫苗的批量溶液中。如果使用福爾馬林，福爾馬林加入的量大約為0.005-0.5％(V/V)，滅活的溫度大約為2-38℃，滅活時間為大約5-180天。然而，當通過這種滅活作用破壞抗原性時，需要用儀器測量改變滅活條件，例如包括減少滅活劑的量、加入中性氨基酸或堿性氨基酸以及降低滅活溫度等。可以通過加入等量的亞硫酸氫鈉中和或者通過透析除去在滅活過程中剩余的游離甲醛。將這樣產生的制劑作為疫苗批量溶液進行下列的過程。疫苗的制備例如在培養基BME中，將疫苗批量溶液稀釋以將其抗原水平調節為產生抗體所需水平。
然后，可以加入增強疫苗耐熱性的穩定劑或作為輔助劑來增加免疫原性的佐劑，使之與批量溶液混合。例如，可以使用糖和氨基酸作為穩定劑；礦物油、植物油、明礬、磷酸鋁、皂土、硅石、胞壁酰二肽衍生物、胸腺素、白細胞介素等作為輔助劑。
為了誘導粘膜的免疫性或局部的免疫性，可以處理或修飾疫苗批量溶液中的病毒抗原。為了誘導，可使用與DDS(藥物轉移系統)相關的技術，在此技術中使用例如脂質體、乳劑、中心體、微膠囊、聚乳酸、聚乙醇酸。
然后，將疫苗溶液分裝到小藥瓶中，例如瓶的體積大約1-20ml，接下來塞住和密封，得到的疫苗溶液就可以使用了。這種疫苗不僅可以以液體形式使用，而且在分裝后可以通過冷凍干燥溶液制成干燥制劑。為了便于口服施用，可以將疫苗溶液加工成，例如糖漿或糖果形式。
關于使用前的質量保證問題，即在疫苗的加工過程中和在把溶液分成小部分的分裝時，要檢驗制備的疫苗制劑的安全性和有效性以驗證這種溶液是否適合作為疫苗。可以按照和本發明輪狀病毒疫苗相似的制劑標準進行檢驗，例如按照藥物法(第145條，1960)和1960年健康和福利部的315號通告和1961年健康和福利部的337號通告(修訂版)的＂生物制劑標準＂中定義的“滅活的急性多脊髓炎疫苗標準”規則；按照上述藥物法和1993年健康和福利部的217號通告的＂生物制劑標準＂中定義的“日本B腦炎疫苗”和“干燥的日本B腦炎疫苗”規則；或者按照上述藥物法和1994年健康和福利部的332號通告中的＂生物制劑標準＂中規定的“干燥組織培養滅活A型肝炎疫苗”規則等。疫苗的劑量例如，以大約0.25-0.5ml的劑量皮下接種疫苗，口服施用的劑量為每次0.1ml；或通過以大約0.05ml的劑量進行口腔注射。而且，這樣的接種最好以2-4周的間隔進行1-3次。然而，疫苗的劑量并不限于上述的例子。診斷試劑的制備以與上述相同的方式制備病毒懸浮液或純化的抗原，這種抗原就可以作為診斷抗原(例如沉淀反應、凝集反應、中和反應、熒光抗體技術、酶免疫測定、放射免疫測定等的抗原)。通過動物(如兔、豚鼠、小鼠等)腹膜、皮下、肌內接種診斷抗原疫苗批量溶液，可是從動物的血清中制備抗體。通過上述的各種診斷方法提供用于抗原測定的抗體。在使用前把按照本發明的診斷抗原和抗體稀釋、將其調整到能夠誘導抗原-抗體反應的量。而且，按照本發明的輪狀病毒的基因組和它的cDNA片段可以作為，例如基因診斷的探針試劑和鑒定試劑。
在下面的實施例中將更詳細地描述本發明，但是本發明并不限于這些實施例。
實施例1(1)細胞克隆在37℃下將Vero細胞(ATCC CCL81)培養在添加了FCS(由美國Gibco公司生產)(最終濃度為9％(V/V))的細胞培養基中以形成單層細胞，培養容器的培養面積為25cm2。用0.25％(W/V)胰蛋白酶(胰蛋白酶1∶250，美國Gibco公司生產)溶液從培養容器的培養區域剝去單層細胞，將細胞分散以將細胞制成游離的單細胞，此后通過低速離心(1500rpm,5分鐘)收集細胞，以便在培養基中制備2個細胞/ml的游離單細胞懸浮液。將懸浮液以每孔0.2ml的量接種在96-孔微量檢驗平板上(Falcon，微量檢驗Ⅲ平板，美國Becton Dickinson公司)，然后在37℃下在CO2培養箱中培養14天，以便在每個孔的表面形成只由單細胞的子代構成的集落。在一個大的容器中依次將每個集落的細胞傳代三次，由此使細胞數量增加，最后得到了每個Vero細胞集落總共40個細胞的懸浮液。(2)輪狀病毒允許克隆細胞株的篩選將在(1)的每個克隆細胞中得到的輪狀病毒培養并增殖以便通過ELISA測定培養物上清液中的輪狀病毒抗原，然后按照下面描述的a)-c)步驟篩選具有遠遠高于克隆前的Vero細胞的抗原滴度的克隆細胞株。
a)在每一個克隆細胞中培養病毒將每個克隆細胞加入到一個微量檢驗平板(96孔；橫向8個孔×縱向12個孔)的橫向8個孔中，然后將每個菌落的總共40個細胞的懸浮液分別以0.2ml/孔的量接種，并在37℃培養以形成每個克隆的單層細胞。此后，將每個孔中的培養液轉移到沒有加血清的新鮮MEM中并進一步培養過夜。37℃下在下面描述的病毒生長的培養基(假如胰蛋白酶的終濃度為20μg/ml)中用胰蛋白酶滅活輪狀病毒AU64毒株液體20分鐘，并加入到每個孔的細胞培養液中，每個孔加入0.05ml，然后在37℃下保持30分鐘以便細胞能吸附病毒。此后，將添加胰蛋白酶(最終濃度為0.5μg/ml)的MEM作為病毒生長的培養基以每孔0.2ml的量加入到每個孔中，并在37℃下將病毒培養增殖7天。在培養結束后，將每個孔中的培養液作為病毒懸浮液(樣品)用于下面的病毒抗原分析測定。在本文中，把克隆前的Vero細胞作為對照。
b)病毒抗原的測定(初步篩選)將A組中的抗輪狀病毒抗體(從豚鼠的超免疫的血清純化的IgG)在50mM碳酸鹽緩沖液(pH9.6)中稀釋，以便制備濃度為1.0μg/ml的抗體溶液。將抗體溶液以0.1ml/孔的量加入到用于ELISA的96孔檢驗平板(ELISA-平板，德國Greiner公司生產)中，然后將平板在4℃下放置過夜以吸附孔表面的抗體。在吸附之后，將每個孔用沖洗溶液[最終濃度為0.05％(W/V)含有Tween20的PBS]沖洗。同時，將上述每種病毒懸浮液在抗體稀釋溶液[在去離子水中把Block Ace(由Snow Brand牛奶工業有限公司生產)稀釋10倍]中稀釋5倍，將得到的每份制備樣品以0.1ml的量加入到每個孔中，并在25℃下進行初步反應90分鐘。在用前面提到的沖洗液沖洗每個孔之后，在抗原稀釋液中將標記的過氧化物酶抗輪狀病毒山羊抗體(由美國Viro Stat公司生產)稀釋2000倍，將生成的抗體溶液以0.1ml/孔的量加入到孔中以進行第二次反應(25℃,90分鐘)。此后，用沖洗液沖洗每個孔，然后以0.1ml/孔的量加入底物溶液[含有終濃度為0.4mg/ml的鄰-苯二胺(Wako Pure化學工業公司生產)和含水的35％(V/V)的過氧化氫溶液(Wako Pure化學工業公司生產)的0.5M檸檬酸-磷酸緩沖液(pH5.0)]，并在室溫下進行10分鐘的生色反應，接下來在每個孔中加入0.05ml的4N硫酸以終止反應。在反應停止后，在波長為490nm的單色射線下測量每個孔的吸收率(OD)。作為上述初步篩選的結果，選擇了比對照高5倍或更多倍OD的6份樣品，并將相應的克隆細胞株進行下面的第二次篩選。c)病毒抗原的測定(第二次篩選)以上面描述(1)相同的方式將6個克隆株培養在微量檢驗平板中，同時，在每個孔的細胞中將AU64毒株培養并繁殖。另外，為了觀察由于MOI不同而引起的生長方面的差異，將病毒懸浮液連續稀釋4倍，將每個系列的樣品裝入到縱向的一行和在橫向的行的2個孔中。另外，使用與初步篩選中相同的方式通過ELISA測定病毒抗原。最后可以得到三種高度允許輪狀病毒增殖的高度允許克隆細胞株，將這些株分別命名為Vero CL-9(FERM BP-6028)、Vero CL-16和Vero CL-81-7。
實施例2輪狀病毒的適應37℃下在細胞培養基MEM[添加了終濃度為9％(v/v)的FCS(美國Gibco公司生產)]中將在實施例1中得到的單個克隆細胞株，即Vero CL-9、Vero CL-16和Vero CL-81-7以及克隆前的Vero細胞對照一起培養，以便形成單個細胞的單層細胞。每個細胞株使用了2個組織培養試管作為培養容器。在單層細胞形成后，將每個容器的培養基換成沒有添加血清的新鮮培養基以便進一步培養過夜。然后，把AU64毒株的病毒懸浮液(0.2ml)接種到每個容器的細胞中，然后在37℃靜置60分鐘以使病毒吸附到細胞上，接下來棄去接種溶液。此后，以每個容器1ml的量將作為病毒增殖培養基的MEM[添加了終濃度為0.5μg/ml的Ⅸ型胰蛋白酶(美國Sigma公司生產)]加入到滾管中，并在37℃下培養7天。在培養結束后，收集培養液并作為病毒懸浮液在-80℃保存。通過使用每一種這些病毒懸浮液重復進行上述培養，將病毒傳代7代。按照熒光抗體技術(FA)和酶抗體技術(EIA)測定每一代病毒懸浮液的感染滴度(FFU)。
將每一個克隆細胞株和對照細胞以上述的相同的方式在chamberslide(美國Nunc公司生產)中培養后，加入每一代的連續稀釋10倍的病毒懸浮液，并在37℃培養2天以固定單個細胞，其后通過直接FA和EIA計算FFU。通過PBS和去離子水輕輕沖洗細胞，然后在添加了終濃度為10％(v/v)甲醇的丙酮中在室溫下浸漬5分鐘，從而把細胞固定。
通過使用抗人輪狀病毒豚鼠超免疫血清進行初步反應，標記的FITC山羊IgG(美國Cappel公司生產)用于第二步反應來進行FA。
同時，通過使用抗A組的輪狀病毒的豚鼠超免疫血清初步反應，標記的過氧化物酶抗豚鼠IgG山羊血清(美國Cappel公司生產)用于第二步反應來進行EIA；使用底物溶液[終濃度為1mg/ml的4-氯-1-萘酚(美國Bio-Rad公司生產)、20％(v/v)甲醇和含有1/1000體積35％(v/v)含水的過氧化氫的Tris-HCl緩沖液]進行生色反應。
上述的FFU測定結果列于表2中。以一種平穩的方式提高了輪狀病毒對實施例1中得到的每種高度允許增殖的克隆細胞株的適應，將具有6.5或更多對數體積(FFU/ml單位)的感染病毒的傳代病毒作為適應Vero細胞的病毒毒株儲存在-80℃下。
圖2克隆細胞株 對照病毒傳代數 Vero CL-9 Vero CL-16 Vero L81-7 Vero CCL811 5.3 4.85.12.72 5.8 5.35.52.73 6.0 5.45.72.84 6.7 6.06.2 -5 6.9 6.16.4 -6 7.2 6.26.6 -7 7.3 6.56.8 -表中的數字對數值(FFU/ml)。-未實驗Vero CCL81克隆前的Vero細胞(ATCC CCL81)實施例3(1)新型人輪狀病毒毒株AU64n的分離以與實施例1中相同的方式，在培養試管中培養AGMK(非洲綠猴腎)細胞以形成單層細胞，此后，在下面描述的病毒分離材料接種的前一天，將培養基換成不含血清的新鮮MEM。
另一方面，按照如下方式制備病毒分離材料。把從感染輪狀病毒的嬰兒中得到的腹瀉排泄物(0.1g)懸浮在0.9ml的MEM中，在生成的懸浮液中加入上述的Ⅸ型胰蛋白酶并混合，使其最終濃度為10μg/ml，將所得到的溶液在37℃保溫20分鐘。此后，使用微型高速離心機在10,000rpm下將懸浮液離心30秒，收集所得的上清液，并用MEM稀釋10倍，然后將稀釋液通過直徑為0.22μm的過濾器消毒。用病毒增殖培養基(添加了Ⅸ型胰蛋白酶(最終濃度為0.5μg/ml)的MEM)將濾液連續稀釋10倍，生成的溶液被定義為病毒分離材料。
在棄去用于AGMK細胞的培養基之后，將上述的1ml每種病毒分離材料加入到每個試管的細胞中。將試管在37℃保溫1小時以將分離材料中的病毒吸附到細胞上，然后棄去接種溶液。在病毒增殖培養基(1ml/試管)中將細胞沖洗一次。在棄去沖洗液后，將新鮮病毒增殖培養基(1ml/試管)加入到單個的細胞中，以進行滾管培養。通過使用培養期間觀察到的CPE冷凍和解凍細胞和培養液，制備樣品。通過ELISA(實施例1)，測定每個樣品中的輪狀病毒抗原，然后，回收抗原陽性的樣品。將經低速離心的樣品的上清液作為初始病毒以用于下面的傳代。(2)新型人輪狀病毒毒株的傳代將Ⅸ型胰蛋白酶加入到初始病毒溶液中并混合，并在37℃溫育90分鐘(下文稱為“病毒激活”)，用與上述(1)中相同的方式用MEM將生成的溶液稀釋10倍，把稀釋液接種并培養在下面描述的新鮮細胞中，以用于病毒的連續傳代。結果，人輪狀病毒毒株包括在AGMK細胞中傳代5代，之后在Vero細胞(ATCC CCL81)中傳代5代和另外在Vero CL-9細胞(FERM BP-6028)中傳代2代(按照規定描述傳代史，例如下面的“AGMK/5,Vero CCL81/5,Vero CL-9/2”)。
按照血清型和病毒基因組RNA的分析方法，通過本發明人在報告(微生物學和免疫學，38(4),p.317-320,1994)中描述的電泳模型分析新近分離的人輪狀病毒毒株的血清型和基因型。分析表明血清型和基因型為G1P1B[4]。由于血清型和基因型與AU64毒株相同，按照表1所示的分類，將新型人輪狀病毒毒株命名為AU64n。(3)AU64n毒株病毒對“AGMK/5,Vero CCL81/5和Vero CL-9/2”的適應通過如下的噬斑克隆進行適應。在CO2培養箱中在6孔Falcon平板(由美國Becton Diclinson公司生產)上培養Vero CL-9細胞，一直到形成單層細胞為止。然后，用不含血清的MEM代替原來的培養基再進行培養過夜。此后，將上述用胰蛋白酶激活的AU64n毒株病毒用病毒增殖培養基稀釋10倍，將生成的溶液以1ml/孔的量接種到細胞中。在37℃下使混合物保溫1小時使病毒吸附到細胞上之后，棄去接種溶液。然后，將添加了瓊脂糖ME(終濃度為0.7(W/V))和0.5μg/mlⅨ型胰蛋白酶的瓊脂培養基[199培養基(FMOBIO產品公司生產)]以2ml/孔的量加入到孔中，在瓊脂凝固后，將平板朝下繼續培養。在病毒接種的第4天和第7天后，分別重新加入瓊脂培養基繼續培養，另外，在第11天，加入添加了終濃度為0.003％(W/V)中性紅(Wako Pure化學工業公司生產)的瓊脂培養基并繼續培養以形成經細胞染色的噬斑。在第12天，收集(克隆)具有較大直徑的分離的單個噬斑。通過與(2)中所述病毒傳代方法相同的方式將噬斑懸浮在MEM中，在VeroCL-9細胞中把病毒增殖1次，此后克隆另一個噬斑。在共進行3次克隆和病毒增殖過程后，另外，在Vero CL-9細胞中進行2代的傳代，接著進行4次噬斑克隆和增殖，并將生成的AU64毒株病毒在Vero CL-9細胞中進一步傳代一次，以便制備人輪狀病毒AU64毒株的原始種子病毒(傳代史為“AGMK/5,Vero CCL81/5,Vero CL-9/12”)。使用與實施例2描述的相同的方式測定每一個傳代水平的感染滴度對數值(FFU/ml)。滴度值如下(按傳代順序)2.5,3.7,4.6,5.4,5.8(在AGMK中傳代5代)；2.8,3.5,3.6,4.0,4.4(在Vero CCL81中傳代5代)；5.9,6.4,6.8,7.0,7.1,7.1,7.1,7.2,7.2,7.2,7.2,7.2，(在Vero CL-9中傳代12代)。
實施例4(1)AU64n毒株病毒的大量培養一次使用10個滾瓶大量培養病毒，將此過程重復8次。具體地說，在使用滾瓶(使用Falcon滾瓶(由美國Becton Diclinson公司生產，產品號為3027)培養后，將Vero CL-9細胞培養基換成不含血清的MEM進一步進行培養過夜，然后棄去培養基。在每瓶細胞中以20ml/瓶的量接種實施例3中獲得的AU64毒株原始種子病毒。在本發明中，原始種子病毒預先用Ⅸ型胰蛋白酶激活。此后，在37℃下把細胞在滾瓶中培養1小時以將病毒吸附到細胞上，并棄去接種溶液，接下來以80ml/瓶的量加入新鮮病毒增殖培養基并在滾瓶中培養2天(37℃)。在停止培養后，將每瓶中的培養物冷凍和解凍，以便制備病毒懸浮液，然后收集此懸浮液。此后，在3000rpm下將病毒懸浮液離心10分鐘，從而得到上清液(每次培養800ml)，將其作為粗提純的病毒懸浮液。按照與實施例3中相同的方式測定通過培養8次而得到的每個單獨粗提純的病毒懸浮液的病毒感染滴度值(×106FFU/ml)。結果，生成的對數滴度值(FFU/ml)為4.9,5.5,10.0,7.0,7.5,8.0,4.2和4.0。(2)AU64n毒株病毒的純化通過使用粗提純的病毒懸浮液，共制備4份樣品，每份樣品1.2升。按照如下的方式純化每份樣品的病毒。將每份樣品粗提純的病毒懸浮液離心(10,000rpm,10分鐘)，收集生成的上清液，然后進行超速離心(19000rpm,6小時)，將沉淀物懸浮在15mM PBS(pH7.5)中，終體積為40ml，是30倍的濃縮溶液。將濃縮溶液離心(10000rpm,10分鐘)并收集上清液，然后將上清液置于30％(W/V)的蔗糖墊層上進行超速離心(38000rpm,3小時)。超速離心后，再次將生成的沉淀物懸浮在15mM PBS(pH7.5)中以得到純化的AU64n菌株病毒。測量了再懸浮的4份樣品(每份樣品6ml)的病毒感染滴度值；同時，通過酚試劑法測定蛋白質。結果，病毒感染滴度(×106PFU/ml)和[蛋白質水平(mg/ml)]如下樣品#1,3.8[1.36]；樣品#2,4.8[1.10]；樣品#3,3.3
；和樣品#4,1.3[1.57]。(3)AU64n毒株病毒的滅活從每份樣品(#1-#4)中收集了3ml再懸浮溶液(純化的AU64n毒株病毒)，將其混合，共12ml，并使用15mM PBS(pH7.5)稀釋，使其蛋白質含量為100μg/ml蛋白質，然后加入福爾馬林，使終濃度為0.1％(V/V)，將生成的溶液在4℃下放置2周。然后在5℃下用15mM PBS(pH7.5)滲析30小時。為了檢驗滲析后的含有滅活的病毒的溶液是否適合作為滅活的輪狀病毒批量溶液，進行了許多試驗。具體地說，按照“日本B肝炎疫苗”中規定的生物制劑標準規則，進行蛋白質含量檢驗、顏色檢驗、無菌檢驗、滅活檢驗、和不存在反常毒性的檢驗，通過使用Vero CL-9細胞進行滅活檢驗。結果證明含有滅活的病毒的溶液適合作為疫苗的批量溶液。(4)抗輪狀病毒感染疫苗的制備使用15mM PBS(pH7.5)稀釋疫苗批量溶液，使蛋白質的含量為50μg/ml，從而制備滅活的AU64n疫苗。同時，從每一種未滅活的4份樣品中取出0.5ml并混合，按照與上述相同的方式將混合的再懸浮液(純化的AU64n毒株病毒)蛋白質含量調整為50μg/ml，將生成的溶液作為粗制的含有AU64n的溶液。(5)滅活的AU64n疫苗致免疫性的測定以10μg蛋白質/劑量的量將滅活的AU64n疫苗接種到4-5周齡的ddy小鼠(共7只)中，共接種2次，間隔2周，在第2周進行抽血。使用粗制的含有AU64n的溶液和15mM PBS(pH7.5)作為對照；在收集血液前將粗制的含有AU64n的溶液接種到19只小鼠中，然后接種到10只小鼠中。通過使用60％噬斑減少方法測定從AU64n毒株得到的每種血清的中和抗體滴度值。列于表3的結果證明生成的疫苗具有極好的致免疫性。
表3用于免疫的抗原中和抗體滴度±置信界限滅活的AU64n疫苗 2.20±0.23粗制的含有AU64n的溶液2.30±0.1215mM PBS,pH7.5≤1.60中和抗體滴度以每個小鼠的普通對數值表示的抗體滴度的幾何平均置信界限在5％水平上顯著(6)滅活的AU64n疫苗的免疫效果通過60％病灶減少方法，對使用抗輪狀病毒的滅活的AU64n疫苗(具有不同的基因型和血清型)接種的7只小鼠的血清的中和能力進行了測定。結果如圖4所示。結果表明，通過使用AU64n毒株作為有效成分而制備的疫苗不僅能有效地預防AU64n毒株的感染，而且能有效地抵抗毒株Wa(其血清型P和基因型與AU64n毒株不同)以及具有不同的血清型G的DS-1毒株的感染。
表4攻擊的病毒血清型P和G[基因型]中和抗體±置信界限AU64n G1P1B[4] 2.19±0.52WaG1P1A[8] 2.43±0.43DS-1 G2P1B[4] 1.90±0.25中和抗體滴度以每只小鼠的普通對數值表示的抗體滴度的幾何平均置信界限在5％水平上顯著實施例5新型人輪狀病毒毒株AU32n的回收通過使用與實施例3中描述的相同方法分離和傳代新型的人輪狀病毒毒株，并測定感染滴度值和分析血清型與基因型。具體地說，通過使用AGMK細胞，從感染輪狀病毒的嬰兒的腹瀉排泄物中分離人輪狀病毒毒株，在同樣的細胞中傳代2代后，將毒株在Vero CL-9細胞中傳代8代[1-3代(噬斑克隆)、第4代(靜止培養)、第5代(噬斑克隆)、第6代(靜止培養)、第7-8代(滾瓶培養)]以得到適應克隆細胞的人輪狀病毒毒株(傳代史為AGMK/3、Vero CL-9/8)。人輪狀病毒毒株的感染滴度對數值(FFU/ml)為6.0。其血清型[基因型]是G9P1A[8]，與AU32毒株的相同。因此，將新型人輪狀病毒命名為AU32n。
實施例6在Vero CL-9中分離輪狀病毒通過使用與實施例3(1)中描述的相同方法分離輪狀病毒。但是，使用Vero CL-9細胞代替AGMK細胞進行分離。
工業實用性本發明提供了與輪狀病毒感染相關的疫苗、診斷試劑和試劑，以及它們的生產方法，因此本發明對人類健康、世界范圍內的醫藥行政管理、環境衛生、牛的飼養、基礎研究工作和輪狀病毒感染的臨床實踐和應用具有很大的貢獻。本發明提供了主要針對于嬰兒嘔吐和腹瀉、白便腹瀉、嬰兒假霍亂等的強有力的預防手段。因此本發明不僅給世界范圍的每個家庭帶來了長期的福利，而且也有益于全世界的從事醫藥和健康事業的工作人員。
權利要求
1．用于產生輪狀病毒的方法，這種方法包括從細胞培養物中克隆出高度允許輪狀病毒增殖的細胞；通過在產生的克隆細胞株中傳代輪狀病毒和使輪狀病毒適應克隆的細胞株來制備一種適應克隆細胞的病毒毒株；培養適應的輪狀病毒毒株或者通過使用適應的輪狀病毒毒株作為親本毒株來制備的重排列毒株作為種子病毒；和從種子病毒的培養基中分離和純化輪狀病毒抗原。
2．按照權利要求1的方法，其中所說的細胞培養物是Vero細胞(ATCC CCL81)。
3．按照權利要求1或2的方法，其中所說的克隆的細胞株是Vero CL-9(FERM BP-6028)。
4．按照權利要求1-3任一之方法，其中所說的輪狀病毒是人輪狀病毒毒株AU32n和/或AU64n。
5．通過按照權利要求1-4任一之方法得到的輪狀病毒抗原。
6．通過使用滅活劑進一步滅活權利要求5的輪狀病毒抗原而制備的滅活的抗原。
7．一種用于輪狀病毒感染的疫苗，這種疫苗包含能引起免疫應答量的權利要求5的輪狀病毒抗原或者滅活的權利要求6的抗原。
8．一種用于輪狀病毒感染的組合的多價疫苗，這種疫苗包含能夠引起免疫應答量的兩種或多種抗原，其中所說的抗原是權利要求5的輪狀病毒抗原或者滅活的權利要求6的抗原，這種抗原的血清型或者基因型各不相同。
9．一種診斷試劑，這種診斷試劑包含能引起抗原-抗體反應量的權利要求5的輪狀病毒抗原或者滅活的權利要求6的抗原。
10．克隆的細胞株Vero C1-9(FERM BP-6028)。
11．適應克隆細胞的人的輪狀病毒菌株AU32n。
12．適應克隆細胞的人的輪狀病毒菌株AU64n。
全文摘要
本發明提供了用于產生輪狀病毒抗原(這種抗原很難大量培養)的方法,這種方法包括從細胞培養物中克隆出高度允許輪狀病毒增殖的細胞;通過在產生的克隆細胞株中傳代輪狀病毒并使輪狀病毒適應克隆的細胞株來制備一種適應克隆細胞的病毒毒株;培養適應的輪狀病毒毒株或者通過使用適應的輪狀病毒毒株作為親本毒株來制備的重排列毒株作為種子病毒;和從種子病毒的培養基中分離和純化輪狀病毒抗原。本發明還通過使用所說的抗原提供了一種輪狀病毒抗原、一種抗輪狀病毒感染的疫苗和所說的疾病的診斷試劑。這些抗原、疫苗和診斷試劑對與輪狀病毒感染相關的基礎研究工作和臨床應用的各個領域可以產生很大的作用。
文檔編號A61K39/15GK1209837SQ97191820
公開日1999年3月3日 申請日期1997年10月20日 優先權日1996年10月18日
發明者中込治, 中込豐子, 村上茂樹, 今川忠 申請人:財團法人阪大微生物病研會