專利名稱：針對乙肝病毒基因的siRNA序列及其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術，涉及基因工程技術領域和生物信息學領域，具體地涉及針對乙肝病毒(HBV)基因的siRNA靶序列的設計、合成及其在體內外抑制HBV的應用。
背景技術：
RNA干擾(RNA interference，RNAi)現象的發現，被《SCIENCE》雜志和美國科學促進會評為2002年十大科學成就之一。RNA干擾是指同源雙鏈RNA的導入引起目標基因的不表達或減效表達，在哺乳動物細胞中，21-23個核苷酸長度的雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)，可有效降解同源RNA，從而阻斷蛋白質的表達，這些特定長度的dsRNA被稱為siRNA(small interferingRNAs)。RNA干擾被稱為RNA基礎上的細胞“免疫”系統。
經證實RNA干擾技術具有以下特點(1)特異性高一個堿基的不同就可導致作用的顯著降低；(2)高效少量siRNA分子就能較徹底抑制細胞內相應基因的表達；(3)穩定由于RNA干擾采用的是雙鏈RNA，它比較穩定，不易被降解，因此RNA干擾不僅在體外，而且在動物體內亦具有較好的效果；(4)篩選周期短針對某一基因的有效siRNA序列篩選的方法較簡單，因此研發周期較短。
RNAi在HIV的體外實驗中取得了較理想的結果。Rossi等將HIV-1編碼rev的基因和與它同源的雙鏈RNA共轉染293細胞，rev基因的表達被顯著抑制；同時將siRNA的抑制效應與反義RNA和核酶等進行了比較，發現只有siRNA組抑制了HIV rev-EGFP的表達，其抑制率達到90％，遠優于反義RNA和核酶組，這一結果同樣被Novina等學者所證實。Novina等用針對CD4的dsRNA能將細胞表面HIV病毒的受體表達減少75％，從而抵抗HIV病毒的感染。因此，針對病毒基因的siRNA是慢性病毒性感染的最佳治療策略，具有廣闊的應用前景。
慢性乙型肝炎是我國的高發疾病之一，是導致肝纖維化和肝癌的主要原因。目前治療乙型肝炎的藥物主要是以α干擾素為主的免疫調節劑和以拉米呋啶、阿德福韋為主的核苷類似物，但治療效果仍不滿意。HBV DNA的持續復制是導致乙型肝炎慢性化的主要原因。因此有效抑制HBV DNA復制，是治療慢性乙型肝炎和控制HBV持續感染的關鍵。
HBV DNA的復制是一個DNA-RNA-DNA的過程，其中前基因組RNA含有病毒DNA上全部遺傳信息，是子代病毒前基因組反轉錄的模板。如果能夠特異性阻斷HBV前基因組RNA的逆轉錄及3.5kb，2.4kb，2.1kb和0.9Kb四種未剪切mRNA的翻譯表達，將有效抑制HBVcccDNA在肝細胞中的再生成和子病毒的產生。因為HBV前基因組RNA的逆轉錄及未剪切mRNA的翻譯過程均發生在細胞漿，容易受到針對靶序列的siRNAs的攻擊而特異性地降解，所以本專利利用RNA干擾技術特異性降解HBV RNAs，達到抗HBV的作用。

發明內容
本發明的目的是根據siRNA的設計原理，提供針對HBV(ayw亞型)S基因的siRNA的cDNA靶序列。根據cDNA靶序列，化學合成法合成siRNA。這2條siRNA分別和報告質粒pGFP-S共轉染HepG2細胞后，可抑制報告基因綠熒光蛋白的表達；這2條siRNA轉染HepG2.2.15細胞后，可有效抑制HBsAg的表達。因此，針對HBV(ayw亞型)S基因的siRNA，可抑制HBsAg的表達，可在制備治療HBV慢性感染的藥物中應用。
本發明提供針對HBV(ayw亞型)S基因的2條siRNA的目標cDNA靶序列為SEQ ID NO.1(anti-s siRNA1)5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGC-3’SEQ ID NO.2(anti-s siRNA2)5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTC-3’具體實施方式
本發明結合實施例作進一步說明。
實施例一 合成干擾RNA體外抑制HBV表面抗原融合基因的表達1.siRNA的設計 根據siRNA的設計原理，從轉錄本AUG起始密碼子開始，搜尋HBV ayw亞型的S基因中的AA序列，記錄跟每個AA 3’端相鄰的19nt作為候選的siRNA靶位點，選擇GC含量在40-55％的siRNA序列，通過Genebank的數據庫的Blast分析，將潛在的序列和相應的人基因組數據庫進行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列，設計針對HBV(ayw亞型)S基因的2條siRNA的目標cDNA靶序列。序列如下(anti-s siRNA1)5’-AAACCTTCGGACGGAAATTGC-3’(anti-s siRNA2)5’-AATACCGCAGAGTCTAGACTC-3’
2.siRNA的化學合成和雙鏈退火 根據siRNA設計原則，分別合成anti-ssiRNA1和anti-s siRNA2的正義鏈和反義鏈如下。每條鏈的5’端為磷酸鹽，3’端羥基化，有兩個堿基外懸，通過化學合成而得。形成雙鏈siRNA的退火處理正義鏈和反義鏈各20μM，加入退火緩沖液(100μM KAc，30mM HEPES-KOH，pH7.4，2mM MgAc2)，90℃水浴1min，37℃水浴1h。
anti-s siRNA15’-ACCUUCGGACGGAAAUUGCdTdT-3’(sense siRNA)5’-GCAAUUUCCGUCCGAAGGUdTdT-3’(antisense siRNA)anti-s siRNA25’-UACCGCAGAGUCUAGACUCdTdT-3’(sense siRNA)5’-GAGUCUAGACUCUGCGGUAdTdT-3’(antisense siRNA)3.anti-s siRNA抑制報告質粒pGFP-S和siRNA共轉染HepG2細胞的綠熒光蛋白表達和HBV S基因表達的實驗(1)報告質粒pGFP-S和siRNA共轉染HepG2細胞 報告質粒pGFP-S是表達報告基因綠熒光蛋白和HBsAg融合蛋白的質粒。HepG2細胞按照1×105/孔接種24孔板，培養24小時后達到80％-90％融合率，共轉染pGFP-S和siRNA，具體步驟參照Invitrogen公司Lipofectamine2000說明書。6小時后換10％FCS DMEM，同時設置只轉染pGFP-S載體的陰性組，每組重復3孔。
(2)熒光顯微鏡觀察細胞綠熒光蛋白表達 轉染48小時后，在倒置熒光顯微鏡(DM IRB，Leica)下觀察綠熒光蛋白在HepG2細胞中的表達情況。結果顯示，與pGFP-S載體的陰性組相比，轉染pGFP-S和anti-S siRNA的HepG2細胞的熒光強度減弱，熒光細胞數減少。
(3)流式細胞儀觀察細胞綠熒光蛋白表達 轉染48小時后，常規消化HepG2細胞，離心懸液，重懸于PBS，流式細胞儀檢測表達熒光蛋白的陽性細胞數比例和平均熒光強度。結果顯示，與pGFP-S載體的陰性組相比，轉染pGFP-S和siRNA的HepG2的陽性細胞數比例降低，平均熒光強度降低。
(4)逆轉錄-實時熒光定量PCR法檢測HBV S基因RNA的表達 RNA準備轉染72小時后，收獲HepG2細胞，Trizol法抽提RNA，方法參照Invitrogen公司說明書。逆轉錄，過程參照MBI操作說明書。
熒光染料法定量PCR，上游引物5′-CTCACAATACCGCAGAGTC-3′；下游引物5′-TAAACTGAGCCAGGAGAAA-3′；
內參照GAPDH，上游引物5′-ACAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3′，下游引物5′-GCAACAATATCCACTTTACCAGAG-3′。PCR條件為95℃3min，再94℃30s，56℃ 30s，72℃ 45s，25個循環，熒光檢測點選擇72℃。同時做陽性對照(直接以pGFP-S質粒DNA為模板組)和陰性對照(不加模板組)。實時定量PCR在25循環定點檢測顯示，與陰性對照相比，anti-S siRNA1和anti-S siRNA2對S基因的抑制率均達到50％以上。
4.anti-s siRNA抑制對siRNA轉染HepG2.2.15細胞的HBsAg和HbeAg表達的實驗(1)siRNA轉染HepG2.2.15細胞 HepG2.2.15細胞按照1×104接種24孔板，培養24小時后達到30％-40％融合率，轉染siRNA各0.84μg，具體步驟參見Invitrogen公司OLIGOFECTAMINE試劑說明書。設置無關對照siGFP組(FEBS Letters 543(2003)51-54)sense RNA 5-GGCUACGUCCAGGAGCGCACC-3，anti-sense RNA 5-UGCGCUCCUGGACGUAGCCTT-3。6小時后換10％FCS DMEM。每組設3個復孔。
(2)放射免疫法檢測HBsAg和HBeAg濃度變化 轉染HepG2.2.15細胞后第48h，分別收集細胞培養液，離心去除細胞碎片，上清進行放射免疫法檢測，檢測方法參見試劑盒說明。轉染anti-S siRNA1和anti-S siRNA2后，HepG2.2.15細胞上清中的HBsAg和HBeAg的濃度較HepG2.2.15細胞低，anti-SsiRNA1和anti-S siRNA2對HBsAg和HBeAg的抑制率均達到50％以上。
本發明是結合最佳實施例進行描述的，然而在閱讀了本發明的上述內容后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.針對乙肝病毒基因的siRNA序列，SEQ ID NO.1為anti-s siRNA1的核苷酸序列AAACCTTCGG ACGGAAATTG C 21。
2.針對乙肝病毒基因的siRNA序列，SEQ ID NO.2為anti-s siRNA2的核苷酸序列AATACCGCAG AGTCTAGACT C 21。
3.根據權利要求1或2所述的針對乙肝病毒基因的siRNA序列，是針對乙肝病毒ayw亞型S基因的目標cDNA靶序列。
4.根據權利要求1或2所述的針對乙肝病毒基因的siRNA序列在制備抑制乙肝病毒復制藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供針對乙肝病毒基因的2條siRNA的cDNA靶序列，SEQ ID NO.1為anti－s siRNA1的核苷酸序列，SEQ ID NO.2為anti－s siRNA2的核苷酸序列。這2條siRNA分別和報告質粒pGFP－S共轉染HepG2細胞后，可抑制報告基因綠熒光蛋白的表達；這2條siRNA轉染HepG2.2.15細胞后，可有效抑制HBsAg的表達。因此，針對HBV(ayw亞型)S基因的2條siRNA，可抑制HBsAg的表達，可在制備HBV慢性感染的治療藥物中應用。
文檔編號A61P1/00GK1637142SQ200410089168
公開日2005年7月13日 申請日期2004年11月29日 優先權日2004年11月29日
發明者陳智, 羊正綱, 朱海紅 申請人:浙江大學