專利名稱：重組腺病毒tmem166作為基因治療藥物在抗腫瘤中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種重組腺病毒TMEM166作為基因治療藥物在抗腫瘤中的應用，特別涉及含有該重組腺病毒TMEM166的誘導腫瘤細胞自噬和凋亡，抑制腫瘤細胞生長的基因治療藥物，并且本發明還涉及該重組腺病毒TMEM166與化療藥物聯合給藥來制備抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
生物體的一切生命活動，從出生、成長、衰老、到出現疾病直至死亡都與基因有夫，基因調控著細胞的各種功能。人們現在已經認識到腫瘤是基因異常的疾病，而惡性腫瘤發病率、死亡率較高，已經成為危害人類生命的第一、二位殺手。近年來，關于腫瘤治療，基因治療尤為引人注目，到目前為止提出了各種各樣的基因治療法，并進行了臨床試驗(例如 參見 Freeman SM, Whartenby KA, Freeman JL, Abboud CN, Marrogi AJ. In situ use ofsuicide genes for cancer therapy. Semin Oncol. 1996Feb ；23(1) :31-45.)。基因治療是指將人的正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或者發揮治療作用，從而達到治療疾病目的的生物醫學新技木。目前，基因治療領域存在的主要問題是有效性和安全性。事實上，自1995年以來，全世界基因治療領域的科學家們在改善基因導入系統和載體方面作了大量的努力，新思路、新技術和新方法層出不窮。目前，在基因導入載體方面出現了兩大主流一是非病毒載體系統；ニ是病毒載體系統。由于非病毒系統導入基因的效率相對較差，故在基因治療臨床試驗中的使用率不到20% ;病毒載體在基因治療領域的應用最為廣泛，大約70%的治療方案采用了病毒載體，包括各種逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、痘病毒等。其中腺病毒載體是基因治療中最常用的病毒載體，它具有包裝容量較大、制備方便且易純化和濃縮、宿主范圍廣、感染效率高等特點(例如參見Deng Hong-Xin, Tian Ling, WeiYu—Quan.しurrent status,problems and prospects in gene therapy. Chinese Bulletinof Life Sciences. 2005 ; 17 (3) 196-200 ；Kovesdi I, Brough D. E, Bruder J.T. andWickham T. J. Adenoviral vectors for gene transfer. Curr Opin Biotechnol,1997,8:583-589.)。廣為人知的重組人p53腺病毒自1995年在美國批準進入臨床試驗，目前已有51項各種臨床試驗方案在世界各國實施，涉及到如肺癌、食管癌、乳腺癌、膀胱癌、腦瘤等多種類型的腫瘤治療(例如參見Nie B, Shen Z, Wen J. B, Wong 0. G, Hsueh ff. D, HuoL.F, Kung H. F, Jiang B and Lin M. C. 2008. AAV-HGFK1 and Ad_p53 cocktail therapyprolongs survival of mice with colon cancer. Mol Cancer Ther 7 :2855-2865. ；Yoo,G. Η. , M. P. Piechocki, J. Oliver, F. Lonardo, L. Zumstein, H. S. Lin, H. Kim, T. Y. Shibuya,N. bhehadeh,and j. F. Ensley. Enhancement of Ad_p53 therapy with docetaxel in headand neck cancer. Laryngoscope,2004,114 1871-1879. ；Swisher, S. G. , and J. A. Roth.Clinical update of Ad_p53 gene therapy for lung cancer. Surg Oncol Clin N Am,2002，11 :521-535.)。
程序性細胞死亡(programmed Cell Death, PO))是細胞的一種主動死亡過程，基于形態可以將P⑶分為兩型，I型P⑶又稱凋亡性細胞死亡，II型P⑶又稱自噬性細胞死亡、例如參見 Levine B and Daniel Klionsky J. Development by self-digestion:molecular mechanisms and Diological functions of autophagy.Dev cell,2004,6(4)463-477 ；Xiang J, Chao DT, Korsmeyer SJ.BAX-induced cell death may not requireinterleukin I β -converting enzyme-like proteases. Proc Natl Acad Sci,1996,93 :14559-14563)自噬性細胞死亡與凋亡在生化指標、參與分子和機理方面均有密不可分的關系，在某些情況下可以相互拮抗或促進，可先后發生或同時共存于同一細胞(例如參見 Cuervo AM. Autophagy in sickness ana in health. Trends Cell Biol, 2004,14(2) :70-77 ；bhmtani T. Autophagy in health and disease a double-edged sword.Science, 2004，306 (5698) :990-995)。對自噬研究的不斷深入，不僅進ー步掲示了真核生物自身調控的復雜性和多祥性，更為腫瘤的治療提供了新的思路。大量研究表明，在多種人類腫瘤中存在有自噬活性的降低，其與腫瘤的發生、發展有密切的關系(例如參見Bertin b, Pierrefite-uarle Autopnagy and toll-like receptors a new link in cancercells. Autophagy. 2008 Nov 16 ；4(8) :1086-1089)。目前人們已經將干預腫瘤細胞自卩遼作為為抗腫瘤藥物開發和檢測腫瘤藥物療效的新靶點。本發明人利用突光素酶報告基因方法(例如參見Lorenz ffff,Longiaru M,CormierMJ. Isolation and expression of a cDNA encoding Renilla reniformis luciferase.Proc Natl Acad Sci USA. 1991 ;88 (10) :4438-42.)篩選出一個能夠明顯下調內參活性并且同時誘導細胞死亡的新基因TMEM166。通過TMEM166的表達，可以達到抑制腫瘤細胞生長的目的，同時為研制治療癌癥的重組腺病毒基因治療藥物奠定了基礎。TMEM166是ー種定位于溶酶體和內質網的新型跨膜蛋白(例如參見Wang L.，Yu C，Lu Y, He P, Guo J, Zhang C，Song Q, Ma D, Shi T and Chen Y. TMEM 166，a noveltransmembrane protein, regulates cell autophagy and apoptosis. Apoptosis, 200(,12 :1489-1502.)。過表達TMEM166，可以明顯抑制Hela細胞的克隆形成，誘導細胞發生程序性細胞死亡，形態學的改變具有細胞自噬和凋亡的雙重特征，且自噬的發生早于凋亡的出現。提示TMEM166可能具有調節凋亡和自噬的雙重作用。在前期研究的基礎上，我們也構建了腺病毒TMEM166，希望利用腺病毒載體的優越性進ー步探討TMEM166的抗腫瘤活性，為其真正作為腫瘤基因治療試劑奠定基礎(例如參JAL Roth, J. A. 2006. Adenovirus p53 gene therapy. Expert Opin Biol Ther 6:55-61·)。前期結果顯示，利用制備的兔抗人TMEM166特異性抗體，結合組織芯片、免疫組化的方法，以及實時定量PCR分析了人體正常組織和腫瘤組織中TMEM166的表達情況，證明腫瘤細胞中TMEM166的表達明顯下調，在正常組織中高表達，提示TMEM166可能是潛在的腫瘤基因治療靶點(例如參見 He P，Peng Z，Luo Y，Wang L，Yu P，Deng ff, An Y，Shi Tand Ma D. High—throughput functional screening for autophagy—reiated genes andidentification of TM9SF1 as an autophagosome-inducing gene. Autophagy,2009,5 52-60.)。構建了 TMEM166腺病毒重組表達載體(人重組Ad5_TMEM166)。本發明利用腺病毒重組表達載體人重組Ad5-TMEM166進行體內外實驗，以期闡明TMEM166的抗腫瘤活性。體外的研究證明TMEM166抑制腫瘤細胞生長、誘導細胞自噬和凋亡；裸鼠移植瘤實驗證實了人重組Ad5-TMEM166感染對于食管癌細胞移植瘤的生長抑制作用，在TMEM166感染的腫瘤組織中，出現大量的細胞凋亡、外圍血管密度降低、組織缺血壞死等，表明腺病毒介導的TMEM166轉基因具有很強的抗腫瘤活性，具有潛在的臨床應用前景。

發明內容
本發明的目的是提供ー種含有人TMEM166基因的重組腺病毒。本發明所提供的重組腺病毒，是將人TMEM166基因的表達盒插入Ad5的基因組DNA中得到的重組腺病毒；所述人TMEM166基因的表達盒包括啟動子、人TMEM166的cDNA和終止子。所述人TMEM166基因的表達盒中，啟動子為CMV啟動子，所述終止子為SV40的終 止子。所述人TMEM166基因的表達盒還包括SV40polyA信號序列。所述人TMEM166基因的表達盒通過如下方法插入Ad5的基因組DNA中利用pAdxsi系統(microbix公司，購自本元正陽基因技術股份有限公司)將人TMEM166的cDNA插入pShuttle-CMV的多克隆位點區，然后將重組后pShuttle-CMV-TMEM166中的TMEM166表達盒經酶切后連接到pAdxsi載體上，最后將重組后Ad5-TMEM166轉染進293細胞，得到含有TMEM166基因的重組腺病毒。本發明的另ー個目的是提供一種誘導腫瘤細胞自噬和凋亡、抑制腫瘤細胞生長的基因治療藥物。該基因治療藥物可用于非實體瘤細胞或實體瘤細胞。本發明還進ー步提供了該基因治療藥物在制備與化療藥物聯合給藥來誘導腫瘤細胞死亡的藥物中的應用。該化療藥物可以是任何ー種化療藥物，優選3-MA和LY294002。實驗表明本發明的重組腺病毒在體內外均有抗腫瘤活性。本發明的重組腺病毒可廣泛用于腫瘤的基因治療。


圖IA為pShuttle_TMEM166的BamHI和EcoR I雙酶切鑒定電泳IB為人重組Ad5_TMEM166的鑒定圖譜圖 2A Western Blot 檢測人重組 Ad5_TMEM166 在 MGC803、SGC7901、AGS、U20S、Saos-2、BGC823、KYSE150腫瘤細胞中的表達，呈濃度依賴性圖 2B Western Blot 檢測人重組 Ad5-TMEMl66 在 U20S、Saos-2, BGC823, KYSE150腫瘤細胞中的表達，呈時間依賴性圖3A CCK8 實驗檢測人重組 Ad5_TMEM166 降低 U20S、Saos-2、BGC823、KYSE150 腫瘤細胞存活率，呈時間依賴性圖3B CCK8 實驗檢測人重組 Ad5_TMEM166 降低 U20S、Saos-2、BGC823、KYSE150 腫
瘤細胞存活率，呈濃度依賴性圖4 人重組 Ad5-TMEM166 誘導 U20S、Saos-2、BGC823、KYSE150 腫瘤細胞發生自噬。A :共聚焦顯微鏡觀察GFP-LC3的斑點狀定位；B :統計學分析人重組Ad5_TMEM166誘導腫瘤細胞發生自噬時GFP-LC3斑點細胞的數目；C =Western Blot檢測人重組Ad5_TMEM166誘導腫瘤細胞發生自噬時GFP-LC3-I蛋白的變化圖5Western Blot檢測人重組Ad5_TMEM166誘導U20S、Saos_2腫瘤細胞發生自噬時P62蛋白的變化圖 6Western Blot 檢測人重組 Ad5_TMEM166 誘導 U20S、Saos-2, BGC823、KYSE150腫瘤細胞發生自噬時mT0R/p70S6K信號通路的變化圖7A 流式細胞術分析人重組 Ad5-TMEM166 誘導 U20S、Saos_2、BGC823、KYSE150 腫瘤細胞凋亡，呈濃度依賴性圖7B流式細胞術分析人重組Ad5_TMEM166誘導U20S腫瘤細胞凋亡，呈時間依賴性 圖8熒光分光光度計檢測人重組Ad5-TMEM166誘導U20S、KYSE150的腫瘤細胞Caspase-3 活性圖9流式細胞術分析人重組Ad5-TMEM166對相對正常HEK293細胞的影響圖10為Ex vivo實驗人重組Ad5_TMEM166對食管癌KYSE150細胞生長的影響。A :分析細胞組、Ad5-Null組、人重組Ad5-TMEM166組的裸鼠成瘤性；B :第20天處死裸鼠取出瘤體并稱重；C :腫瘤組織照片；D :動態檢測細胞組、Ad5-Null組、人重組Ad5-TMEM166組的裸鼠動物體重。圖11為In vivo實驗人重組Ad5_TMEM166對食管癌KYSE150細胞生長的影響。A :分析細胞組、Ad5-Null組、人重組Ad5-TMEM166組的裸鼠成瘤性；B :第20天處死裸鼠取出瘤體并稱重；C :腫瘤組織照片；D :動態檢測細胞組、Ad5-Null組、人重組Ad5-TMEM166組的裸鼠動物體重。圖12為In vivo實驗免疫組化方法檢測人重組Ad5_TMEM166對移植瘤細胞中Ki-67的表達。A :免疫組化方法分析細胞組、Ad5-Null組、人重組Ad5_TMEM166組腫瘤細胞Ki-67的表達；B :統計學分析的結果圖13為In vivo實驗=TUNEL方法檢測人重組Ad5_TMEM166誘導移植瘤細胞發生凋亡。A =TUNEL方法分析細胞組、Ad5-Null組、人重組Ad5_TMEM166組腫瘤細胞凋亡細胞；B :統計學分析的結果圖14為In vivo實驗免疫組化方法檢測人重組Ad5_TMEM166對移植瘤組織微血管密度(Microvessel Density, MVD)的影響。A :免疫組化方法分析細胞組、Ad5_Null組、人重組Ad5-TMEM166組腫瘤細胞⑶31蛋白的表達；B :細胞組、Ad5_Null組、人重組Ad5-TMEM166組腫瘤組織的H&E染色。圖15為In vivo實驗H&E染色分析細胞組、Ad5_Null組、人重組Ad5_TMEM166處理組重要臟器的影響圖16為In vivo實驗Western Blot分析細胞組、Ad5_Null組、人重組Ad5-TMEM166處理組中腫瘤組織中自噬蛋白P62的表達表I為Ad_TMEM166對U20S細胞的化療協同效應表2為Ad-TMEM166對BGC823細胞的化療協同效應
具體實施方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。實施例I、人Ad5_TMEM166重組腺病毒的構建、鑒定及純化經PCR擴增得到TMEM166的cDNA片段，然后將TMEM166的片段和pShutt le-CMV (來自本室)用 BamHI 和 EcoR I (購自 New England Biolabs 公司)切開，純化和回收相應的片段后，用T4連接酶(購自北京晶美生物公司)將TMEM166基因連接到pShuttle-CMV質粒上，篩選 陽性克隆，得到含有TMEM166基因(參見序列表I)的質粒，構建成 pShuttle-CMV-TMEM166。其中，pShuttIe-CMV質粒含有以下元件I. Kanr :為質粒在E. coli (如DH5 α )中擴增提供卡納抗性(終濃度100 μ g/ml)。2. ori :質粒在E. coli中的復制起點。3. Ad =Ad序列，可以與Ad基因組質粒發生同源重組。4. CMV :來自MCMV病毒的立早啟動子。5. SV40polyA :來自SV40病毒T抗原的mRNA加尾信號。將重組后的pShuttle-CMV_TMEM166用BamHI和EcoR I進行雙酶切，酶切產物進行電泳檢測，質粒酶切鑒定結果參見圖1A,其中，M :Marker (lkb DNAladder), I :為陽性克隆。將重組pShuttle-CMV_TMEM166酶切后與pAdxsi載體(來自本室)進行連接，然后轉染293細胞，最終得到含有TMEM166基因的重組腺病毒。對Ad_TMEM166重組腺病毒進行酶切鑒定。結果參見圖IB所不，M :Marker (lkb DNA ladder), I :為陽性克隆對照病毒Ad-null和Ad5_GFP (不含外源目的基因的重組腺病毒)用同樣方式構建。病毒繁通、純化、滴度測定按Graham等人(Graham F L,Prevce L,Gene transfer andexpression protocols Methods in Molecular Biology,Vol 7. Murray Z J ed. Clifton,NJ The Humane Press Inc, 1991. 109-128)的方法進行。Ad_TMEM166 及 Ad-null 毒種各生產50個125cm2培養瓶病毒，收獲的病毒經純化后進行質檢，滴度為I X 10nPFU/ml。實施例2 Ad5-TMEM166在腫瘤細胞的表達呈濃度依賴性和時間依賴性KYSE150細胞培養于含10% FBS的1640培養基中，置于37°C，5% C02孵箱中培養。U20S、Saos-2 細胞培養于含 10% FBS (購自 HyClone, SH30084. 03)的 DMEM(購自 HyClone,SH30022. 01B)培養基中，置于 37°C，5 % C02 孵箱中培養。SGC7901、MGC803、BGC823 細胞細胞培養于含 5% FBS (購自 HyClone，SH30084. 03)的 DMEM (購自 HyClone，SH30022. 01B)培養基中，置于37°C，5% C02孵箱中培養。AGS細胞培養于含10% FBS(購自HyClone，SH30084. 03)的 F12(購自 HyClone, SH30026. 01B)培養基中，置于 37°C，5% C02 孵箱中培養。(上述細胞均購自美國ATCC)分別感染MOI為100、200、400、800、1600的Ad5_TMEM166和MOI為200的Ad5-Null，24小時后，收集細胞，按標準的免疫印記程序進行電泳、轉膜、封閉等操作。U20S、Saos-2、BGC823、KYSE150四種腫瘤分別感染MOI為200的Ad5_TMEM166和MOI為200的Ad5-Null，24、48、72小時后，收集細胞，按標準的免疫印記程序進行電泳、轉膜、封閉等操作。ー抗使用抗TMEM166多克隆抗體(由本實驗室制備)，然后將膜用相應的Alexa Fluor 780-標記的IgG第二抗體(購自LI-C0R BIOSCIENCE INC)室溫避光孵育I小吋。TBS-T洗膜三次，每次10分鐘。固定于膜上的可被紅外線激發的熒光團在780nm激發光的作用下，其波長為820nm的發射光可被LI-COR紅外成像系統(購自LI-COR BI0SCIENCEINC)的信號檢測器檢測到。結果參見圖2所示，人重組Ad5_TMEM166在腫瘤細胞的表達呈現濃度依賴性(圖2A)和時間依賴性(圖2B)。實施例3 Ad5-TMEM166降低腫瘤細胞存活率，呈現濃度依賴和時間依賴性U20S、Saos-2、BGC823、KYSE150腫瘤細胞(上述細胞均購自美國ATCC，培養方式同實施例3)分別感染MOI為200的Ad5-TMEM166或MOI為200的Ad5_Null，感染24、48、72小時后，加入10μ L的CCK8試劑(Cell Counting Kit_8，購自日本同仁化學CK04)，繼續培養 2 小時，用 EL-311SX ELISA Reader (購自 Bio-Tec Instruments)測定 450nm 波長的吸光度。細胞存活率為實驗組的吸光度值/對照組的吸光度值X 100%。^<0.05，# < O. 01，***p < O. 001
結果參見圖3A所示，人重組Ad5-TMEM166時間依賴性降低U20S、Saos_2、BGC823、KYSE150腫瘤細胞存活率。U20S、Saos-2、BGC823、KYSE150腫瘤細胞(上述細胞均購自美國ATCC，培養方式同實施例3)分別感染MOI為100、200、400、800的Ad5_TMEM166或Ad5_Null，培養72小時后，加入IOyL的CCK8試劑，繼續培養2小時，用EL-311SX ELISAReader(購自Bio-TecInstruments)測定450nm波長的吸光度。細胞存活率為實驗組的吸光度值/對照組的吸光度值 X 100%。*p < O. 05，**p < O. 01，***p < O. 001。結果參見圖3B所示，人重組Ad5-TMEM166濃度依賴性降低U20S、Saos_2、BGC823、KYSE150腫瘤細胞存活率。實施例4 Ad5-TMEM166誘導腫瘤細胞發生自噬我們將U20S、Saos_2、BGC823、KYSE150四種腫瘤細胞(上述細胞均購自美國ATCC，培養方式同實施例3)分別感染MOI為50的Ad5-GFP-LC3和MOI為200的Ad5_TMEM166，或MOI為50的Ad5-GFP-LC3和MOI為200的Ad5_Null，17-20小時后共聚焦熒光顯微鏡(購自美國Laica公司)觀察GFP-LC3的斑點結構，GFP-LC3計數結果為GFP-LC3斑點細胞數/總GFP陽性細胞數。同時Western Blot分析GFP-LC3蛋白水平，ー抗使用LC3抗體(購自Cell Signaling公司)，ニ抗使用Alexa Fluor 780-標記的IgG抗體(購自LI-CORBIOSCIENCE INC)。結果參見圖4，人重組Ad5-TMEM166感染后的腫瘤細胞，GFP-LC3呈斑點/塊狀分布的細胞比例明顯增加(圖4A，4B)。并且發現I型GFP-LC3蛋白的含量顯著減低，提示細胞內LC3蛋白的消耗增加(圖4C)。我們進ー步分析了代表自噬流量的標志物p62的變化(圖5)。U20S和Saos_2腫瘤細胞(上述細胞均購自美國ATCC，培養方式同實施例3)分別感染MOI為100、200、400、800、1600 的 Ad5-TMEM166 和 MOI 為 400 的 Ad5_Null，24 小時后，收集細胞進行 WesternBlot, —抗使用p62抗體(購自日本MBL公司)，ニ抗使用AlexaFluor 780-標記的IgG抗體(購自 LI-COR BIOSCIENCE INC)。結果參見5，隨著MOI濃度的增高，p62蛋白水平明顯下調，顯示自噬流的增カロ(Kabeya, Y. , N. Mizushima, T. Ueno, A. Yamamoto, T. Kirisako, T. Noda, E. Kominami,Y. Ohsumi, and T. Yoshimori. 2000. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, islocalized in autophagosome membranes after processing. Embo J 19:5720-5728·)。實施例5 Ad5-TMEM166誘導細胞自噬通過mT0R/p70S6K信號通路為進ー步掲示Ad5-TMEM166感染引起細胞自噬的分子機制，我們將KYSE150、BGC823、U20S以及Saos-2細胞(上述細胞均購自美國ATCC，培養方式同實施例3)分別感染MOI為400的Ad5-TMEM166、MOI為400的Ad5_Null或未處理的細胞，培養17-20小時后，收獲細胞并進行Western Blot檢測，分析磷酸化的mTOR(購自美國Cell SignalingTechnology 公司)、憐酸化的 p70S6K (購自美國 Cell Signaling Technology 公司)以及p62(購自日本MBL公司)蛋白水平,ニ抗使用Alexa Fluor 780-標記的IgG抗體(購自LI-COR BIOSCIENCE INC)。結果參見圖6，Ad5-TMEM166 感染的 KYSE150、BGC823、U20S 以及 Saos-2 腫瘤細胞中，p-mT0R、p-p70S6K以及p62蛋白水平均有所下降，并且mT0R、S6K總量沒有明顯變化，結果提示Ad5-TMEM166誘導細胞自噬是通過抑制經典的mT0R/p70S6K信號通路介導的。 實施例6 Ad5-TMEM166誘導腫瘤細胞凋亡，呈濃度依賴性和時間依賴性目前認為，程序性細胞死亡主要包括細胞凋亡和自噬性程序性細胞死亡，并且許多調節細胞自噬的重要信號分子都直接參與細胞凋亡的調控，例如mT0R，p70S6K等。于是在進行細胞自噬檢測的同時，本發明也對人重組人重組Ad5-TMEM166能否引起細胞凋亡進行了鑒定。將U20S、Saos_2、BGC823、KYSE150腫瘤細胞(上述細胞均購自美國ATCC，培養方式同實施例3)分別感染MOI為100、200、400、800、1600的人重組Ad5_TMEM166或Ad5_Null，培養24小時后收集細胞培養上清于離心管，胰酶消化細胞，一井轉入離心管，I，500rpm離心5分鐘，棄上清，PBS洗滌細胞2次，重懸于200 μ I結合緩沖液(IOmM HEPES, pH 7. 4，140mMNaCl, ImM MgCl2, 5mM KC1,2. 5mM CaCl2)，加入終濃度為 O. 5 μ g/ml 的 FITC-Annexin-V (購自美國BD公司556547)，室溫避光反應20分鐘后加入終濃度為I μ g/ml的PI (購自美國BD公司556547)，根據細胞濃度補上200-400 μ I結合緩沖液，立即進行流式細胞術分析Annexin V的陽性細胞，為細胞凋亡的數目(圖7Α)。U20S腫瘤細胞(上述細胞均購自美國ATCC，培養方式同實施例3)分別感染MOI為200的人重組Ad5-TMEM166或Ad5_Null，培養24、48和72小時后分別于24小時后和48小時后收集細胞培養上清于離心管，胰酶消化細胞，一井轉入離心管，l,500rpm離心5分鐘，棄上清，PBS洗滌細胞2次，重懸于200 μ I結合緩沖液(IOmM HEPES, pH 7. 4，140mM NaCl，ImM MgCl2, 5mM KCl，2· 5mM CaCl2)，加入終濃度為 O. 5 μ g/ml 的 FITC-Annexin-V (購自美國BD公司556547)，室溫避光反應20分鐘后加入終濃度為I μ g/ml的PI (購自美國BD公司556547)，根據細胞濃度補上200-400 μ I結合緩沖液，立即進行流式細胞術分析Annexin V的陽性細胞，為細胞死亡的數目(圖7Β)。U20S和KYSE150腫瘤細胞(上述細胞均購自美國ATCC，培養方式同實施例3)分別感染MOI為200的人重組Ad5-TMEM166或Ad5_Null，培養20小時后，收獲細胞并應用POLARstar Galaxy熒光分光光度計(購自德國BMG公司)檢測Caspase-3活化情況。具體操作如下細胞在全細胞裂解液(IOmM Tris-HCl，pH7. 5，130mM NaCl,l% Triton X-100，ImM PMSF)中冰上裂解30分鐘，蛋白質濃度用BCA蛋白檢測試劑盒測定(Pierce，USA)。取5yg細胞總蛋白，與Caspase-3活性檢測緩沖液(25mM HEPES，pH 7. 5, IOOmM NaCl,ImM EDTA,0. 1% CHAPS, IOmM DTT)，熒光底物 Ac-DEVD_AMC(20 μ M)在 37°C共同孵育。使用POLARStar (BMG Labtechnology, Germany)熒光分光光度計檢測AMC釋放量，激發光380nm，發射光460nm。每10分鐘測定一次，連續監測120分鐘。以熒光強度的增加值代表Caspase-3酶活性，每個樣品做三個重復孔。結果參見圖7-8，Ad5_Null不能誘導細胞死亡，但人重組Ad5_TMEM166能夠明顯誘導腫瘤細胞凋亡，且呈濃度依賴性和時間依賴性。同時，與Ad5-Null比較，U20S, KYSE150細胞感染人重組Ad5_TMEM166后，能夠明顯激活的Caspase-3活化。實施例7人重組Ad5_TMEM166不能誘導相對正常的細胞死亡為了進ー步判斷人重組Ad5_TMEM166用于基因治療的可能性，本發明用其感 染相對正常細胞并檢測其毒性。我們將人胚腎HEK-293細胞(購自美國ATCC，培養方式同實施例3)分別感染MOI為200的人重組Ad5-TMEM166或Ad5_Null，培養24小時或48小時后，收獲細胞并進行流式細胞術分析(圖9A)。人胚肺二倍體成纖維2BS細胞(購自美國ATCC，培養方式同實施例3)感染MOI為200人重組Ad5-TMEM166或Ad5-Null，培養48小時，收獲細胞并進行流式細胞術分析(圖9B)。結果圖9A和9B，人重組Ad5_TMEM166不能誘導相對正常的細胞死亡，說明人重組Ad5-TMEM166可能具有潛在基因腫瘤治療的價值。實施例8 Ex vivo實驗人重組Ad5-TMEM166在體內抑制食管癌KYSE150細胞的生長在接種腫瘤細胞前，連續兩天腹腔注射環磷酰胺100mg/kg體重。然后，將處于對數生長期、活力狀態良好的KYSE150細胞(購自美國ATCC，培養方式同實施例3)，在體外分別用Ad5-TMEM166及Ad5-Null腺病毒感染細胞(Μ0Ι 100)，未感染細胞作為對照，感染24小時后將細胞注射到裸鼠(購于北京維通利華實驗動物技術有限公司)體內(2X 106/100 μ L/點)，待細胞組裸鼠成瘤后，每天測量腫瘤直徑求得腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。收獲時，對小鼠臟器進行取材處理。結果參見圖10Α，與細胞組和Ad5_Null組相比，人重組Ad5_TMEM166組的裸鼠成瘤非常緩慢甚至不成瘤(P < O. 0001)。第20天處死裸鼠并拍照(圖10C)，同時取出瘤體并稱重，見圖10B。結果發現人重組Ad5-TMEM166組的平均瘤重明顯低于細胞組和Ad5-Null組(P < O. ΟΟΙ,ρ < O. 0001)。同時，通過動態檢測動物體重，沒有發現人重組Ad5-TMEM166的毒副作用(圖10D)。實施例9 In vivo實驗人重組Ad5_TMEM166抑制食管癌KYSE150細胞的生長開始實驗前，所有動物(裸鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司)在各分組籠中放置I周，使其適應新實驗環境。接種腫瘤細胞前，連續兩天腹腔注射環磷酰胺100mg/kg體重。然后，將處于對數生長期、活力狀態良好的KYSE150細胞(購自美國ATCC，培養方式同實施例3)，制成單細胞懸液，無血清培養液懸浮細胞濃度為2X IOfVlOOyLtj隨機分成3組，每組6只裸鼠。對照組(6只)0.9%生理鹽水；Ad5-Null對照組(6只)；Ad5-TMEM166治療組(6只)。于每只裸鼠右側腋窩皮下接種細胞濃度為2X 106/100 μ L/點，接種后每天觀察接種點有無紅腫及瘤結節的出現。每隔I天用游標卡尺測腫瘤寬徑(a)、長徑(b)，觀察腫瘤體積的變化，按V = a2Xb/2換算出腫瘤的近似體積，繪制腫瘤生長曲線。實驗期間，稱量裸鼠體重以評價裸鼠對藥物的副反應。待腫瘤體積為100mm3，Ad5-Null對照組進行每隔3天濃度MOI 100的瘤內注射，Ad5-TMEM166治療組進行每隔3天濃度MOI 100的瘤內注射，共四次。待腫瘤長到單側大于20mm，或者雙側大于15mm后，將動物處死，剝離腫瘤，稱量移植瘤的重量(mg),計算最大腫瘤抑制率(Maximal tumor inhibition)(處理組/對照組，τ/c值)，腫瘤組織用10%中性福爾馬林液固定。結果參見圖11，隨著病毒的瘤內注射治療，人重組Ad5_TMEM166處理組的腫瘤體積明顯小于對照細胞組和Ad5-Null組，從第16天開始與Ad5-Null組相比具有統計學意義ΓΡ<0.01)(如圖IlA所示)。這些結果說明在人重組Ad5-TMEM166能減慢裸鼠體內KYSE150成瘤的速度。圖12B和12C顯示從裸鼠剝離的瘤體大小。稱重后發現，人重組Ad5-TMEM166組的平均瘤重明顯低于細胞組和Ad5_Null組ΓΡ < O. 001)。同時通過檢測動物體重(圖12D)，沒有發現人重組Ad5-TMEM166的毒副作用。應該指出的是，在TMEM166處理組，常發現雖然腫瘤組織包膜完整，但是內容物卻壞死液化，因而腫瘤重量明顯減輕。實施例10 In vivo實驗Ki_67檢測人重組Ad5_TMEM166明顯抑制移植瘤細胞的 增殖動物的處理同實施例9。利用免疫組化方法從剝離的腫瘤組織中檢測細胞中Ki-67(購自北京中杉金橋生物技術有限公司)的表達，分析腫瘤細胞增殖情況。具體實驗步驟如下石蠟切片的制作(I)固定取實驗各組的小鼠腫瘤組織用10%的甲醛溶液及時充分固定；(2)修塊取固定好的腫瘤組織,用解剖刀分割成5 8mm小塊，70%酒精清洗3次后，浸泡于70%酒精過夜；(3)脫水經梯度こ醇(80% 100% )將組織內的水份置換出，具體過程如下，80%こ醇(2 3小時)一90%こ醇(2 3小時)一95%こ醇I (2小吋)一95%こ醇II (2小吋)一無水こ醇I (2小吋)一無水こ醇II (2小吋)；(4)透明將脫好水的組織塊浸入ニ甲苯I 20分鐘，ニ甲苯II 20分鐘，充分透明；(5)浸蠟透明好的組織塊浸入65°C蠟I中30分鐘，65°C蠟II中30分鐘。浸蠟可去除組織中的透明劑，増加其硬度，便于切成薄片。石蠟溫度不宜過高，以高于石蠟熔點2°C為宜，溫度過高，時間過長，會使組織塊變硬，變脆，收縮，不利于切成完整的切片；(6)包埋在組織包埋機上操作，注意組織切面朝下，擺放平整；(7)切片包埋好的蠟塊置于切片機，調節好所需切片厚度，按操作規程進行切片。用毛筆和眼科鑷子在42°C 45°C的溫水中把切片打開，組織切片最好無褶皺，平整，刀痕、跳片現象。將理想的切片用載玻片(做免疫組化的切片需用涂有明膠粘片劑的載玻片)撈起。標記切片，分別置于32°C、37°C、52°C烘箱中烘烤24h以上。免疫組織化學染色(I)脫蠟前，應將組織切片置于55-60°C恒溫箱中烘烤30分鐘；(2)脫蠟石蠟切片置于ニ甲苯替代物Ι、Π中各浸泡20分鐘，至透明為止；(3)梯度酒精水化將脫臘后的組織切片于100 %こ醇、100 %こ醇、95 %こ醇、95 %こ醇、85 %こ醇各浸泡5分鐘X I次；(4)去除內源性過氧化物酶新鮮配置3% H2O2 (135ml甲醇+15ml 30%H2O2),室溫下避光孵育9分鐘；(5)抗原修復抗原修復液為朽1檬酸-梓檬酸鈉緩沖液，將抗原修復液微波高火加熱至沸騰，將切片放入，再用微波高火加熱2分鐘，自然冷卻至室溫；(6)封閉用正常羊血清工作液室溫封閉20分鐘；(7)鼠抗Ki-67單抗反應滴片，カロI 250相應ー抗(以PBS稀釋)，37°C孵育I小吋；(8) PBS清洗5分鐘X3次；(9) ニ抗反應對應加入相應HRP標記的兔抗鼠IgG (以PBS稀釋)，室溫反應20分鐘；(IO)PBS洗5分鐘X3次；(Il)DAB顯色，滴片，鏡下觀察反應結果，蘇木精復染細胞核后，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察并記錄結果。
每張切片隨機選擇5個高倍視野由兩位觀察者在雙盲情況下進行評價，計算Ki-67陽性細胞數占據總細胞數的比例，認定為陽性率。結果參見圖12，圖12A所示，人重組Ad5-TMEM166組Ki_67陽性信號最弱，對照細胞組和Ad5-Null組Ki-67陽性信號強。高倍鏡下，隨機選取5個視野，計算陽性細胞數占視野內總細胞數的比例，如圖12B所示，人重組Ad5-TMEM166組的Ki_67表達明顯低于對照細胞組和 Ad5-Null 組，P < O. 0001。實施例11 In vivo實驗TUNEL檢測人重組Ad5_TMEM166明顯誘導移植瘤細胞的
凋亡
動物的處理同實施例9。用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺ロ末端標記法，SPTUNEL法(購自美國羅氏)從剝離的腫瘤組織中檢測裸鼠移植瘤中凋亡細胞的情況。具體步驟如下(I)移植瘤組織標本甲醛固定后用石蠟包埋，5 μ m連續切片，脫蠟，脫水；(2)切片加入100 μ L通透液(O. 1% Triton X-100,0. I %枸櫞酸鈉)，覆蓋整個標本，37°C下孵育8分鐘，進行標本通透性處理；(3) PBS洗三次，每次5分鐘。每個標本滴加3%H202 IOOyL,覆蓋整個標本,室溫下孵育8分鐘，滅活內源性過氧化物酶；(4) PBS洗三次，每次5分鐘。滴加50 μ L TUNEL反應混合物(TUNEL reaction mixture)，37°C孵育60分鐘，期間配制標記反應混合物；(5) PBS洗三次，每次5分鐘。滴加50 μ L Convert-POD，37°C孵育30分鐘；(6)PBS洗三次，每次5分鐘。滴加50 μ L DAB底物，室溫下孵育10分鐘；(7) PBS洗三次，每次5分鐘。(8)蘇木素復染，HCl分化，梯度酒精脫水干燥，ニ甲苯透明化處理，中性樹膠封片。
(9)結果判定細胞核中有棕黃色顆粒為凋亡細胞，通過熒光顯微鏡觀察蠟片，即隨機選擇5個視野(Χ400)中的凋亡細胞和凋亡小體，這些區域中的陽性染色細胞核數量與總細胞核數量的比值被定義為凋亡指數(apoptosis index,Al) ,Al =(總凋亡細胞數量/總腫瘤細胞數量)X 100%，取其平均值作為該裸鼠腫瘤組織的腫瘤細胞凋亡指數。結果參見圖13A和13B，人重組Ad5_TMEM166組的移植瘤內凋亡的細胞明顯多于對照細胞組和Ad5-Null組，P < 0. 0001。實施例12 In vivo實驗人重組Ad5_TMEM166明顯降低移植瘤組織微血管密度(Microvessel Density, MVD)，促進腫瘤組織缺血壞死新生血管形成是腫瘤生長、轉移的前提，作為多種腫瘤預后標志的腫瘤組織微血管密度(Microvessel Density,MVD)受到廣泛關注。CD31作為內皮細胞標志，在非成熟的腫瘤血管及成熟血管中均有表達，MVD-⑶31能精確反映腫瘤血管數量。動物的處理同實施例9。利用免疫組化的方法從剝離的腫瘤組織中檢測了CD31(購自北京博奧森生物技術有限公司)在移植瘤組織中的表達。具體實驗步驟同實施例10結果參見圖14，圖14A顯示人重組Ad5_TMEM166組的移植瘤內MVD數目明顯低于對照細胞組和Ad5-Null組。另外，腫瘤組織的H&E染色表明，人重組Ad5-TMEM166組的移植瘤內有大量的缺血壞死，以及瘤細胞溶解現象，而對照細胞組和Ad5-Null組較少，見圖14B所示。實施例13 In vivo實驗人重組Ad5-TMEM166對于KYSE150移植瘤裸鼠的重要臟
器無明顯毒性動物的處理同實施例9。將KYSE150移植瘤實驗各組裸鼠的心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟重要臟器進行石蠟切片，并進行H&E染色。具體實驗步驟如下(I)脫蠟60°C烘烤蠟片過夜，將烘烤好后的切片進行脫蠟，ニ甲苯I，室溫，20分鐘一ニ甲苯II，室溫，15分鐘。(2)水化梯度酒精100%こ醇I，室溫浸泡，5分鐘一100%こ醇II，室溫浸泡，5分鐘—95%こ醇,室溫浸泡,5分鐘一90%こ醇,室溫浸泡,5分鐘一80%こ醇,室溫浸泡,5分鐘—70%こ醇，室溫浸泡，5分鐘一蒸餾水I，室溫浸泡，5分鐘一蒸餾水II，室溫浸泡，5分鐘。
(3)染色用濾紙過濾蘇木精后，將水化好的切片置于其中，室溫浸泡，40秒一自來水沖洗(稍洗)一I %鹽酸こ醇，室溫浸泡,2秒一自來水沖洗(稍洗)一I %氨水,室溫浸泡,2秒—蒸餾水I，室溫浸泡，3分鐘一蒸餾水II，室溫浸泡，3分鐘一伊紅，室溫浸泡，I分鐘一蒸懼水稍洗一70%こ醇,室溫浸泡,30秒一80%こ醇,室溫浸泡,30秒一90%こ醇,室溫浸泡，5分鐘一95%こ醇，室溫浸泡，5分鐘一100%こ醇I，室溫浸泡，5分鐘一100%こ醇II，室 溫浸泡，5分鐘一ニ甲苯I，室溫浸泡，10分鐘一甲苯II，室溫浸泡，10分鐘。(4)封片將染色完成的切片，ニ甲苯未完全干燥，迅速用滴管吸取中性樹膠滴在組織上，蓋好蓋玻片，凝固后便可觀察。結果參見圖15，人重組Ad5-TMEM166對于小鼠重要臟器無毒副作用。實施例14 In vivo實驗Western Blot證明人重組Ad5_TMEM166處理的腫瘤細胞自噬水平上調。動物的處理同實施例9。利用Western Blot從剝離的腫瘤組織中檢測了 p62 (購自日本MBL公司)的表達水平。結果參見圖16，人重組Ad5_TMEM166處理的腫瘤組織p62表達下調，證明自噬水平上調。實施例15腫瘤化療藥物增加TMEM166誘導的腫瘤細胞死亡3-甲基腺嘿呤(3-Methyladenine, 3-MA,購自美國 sigma 公司)和 LY294002(購自美國sigma公司)是PI3K/AKT抑制劑，也是腫瘤的化療藥物(例如參見QadirMA, Kwok B，Dragowska WH, To KH, Le D，Bally MB, Gorski SM. Macroautophagyinhibition sensitizes tamoxifen-resistant breast cancer cells and enhancesmitochondrial depolarization.Breast Cancer Res Treat.2008，112 :389-403 ；Beurel，E.，M.Kornprobst，M.J. Blivet-Van Eggelpoel, A.Cadoret，J.Capeau, andC. Desbois-Mouthon. 2005. GSK_3beta reactivation with LY294002 sensitizeshepatoma cells to chemotherapy-induced apoptosis. Int J Oncol 27:215-222·)。在人重組Ad5-TMEM166感染的的U20S、BGC823，(上述細胞均購自美國ATCC，培養方式同實施例3)，加入50 μ M的LY294002，24小時或48小時后，收獲細胞，流式細胞術分析細胞死亡的情況。結果參見表1，Ad-TMEM166能夠誘導的U20S細胞死亡，MOI為200時是5. 19%，MOI 400時為13. 32% ；LY294002藥物單獨處理的細胞死亡是5. 88%，當LY294002藥物分別與MOI 200和MOI 400的Ad_TMEM166聯合處理細胞，細胞死亡率分別上升到31. 38%和77. 86% (Μ0Ι 400)，兩者聯合應用導致細胞死亡的數目顯著升高。3-MA藥物單獨處理的細胞死亡是10. 76%，當3-MA加入到已轉染TMEM166質粒的U20S中，24小時后流式細胞術分析細胞死亡的情況，細胞死亡的數目上升到38. 28%。從表2可見，Ad-TMEM166能夠誘導的BGC823細胞死亡，MOI為200時是10. 43%,MOI 400時為15. 82%%；LY294002藥物單獨處理的細胞死亡是11. 44%，當LY294002藥物分別與MOI 200和MOI 400的Ad_TMEM166聯合處理細胞，細胞死亡率分別上升到25. 83%和36. 47%，兩者聯合應用導致細胞死亡的數目顯著升高。上述結果初步提示，3-MA和LY294002作為腫瘤的化療藥物，能夠增加TMEM166誘導的腫瘤細胞細胞死亡，反過來說，TMEM166也能増加化療藥物的敏感性，特別是耐藥細胞的敏感性。表I TMEM166和化療藥物協同誘導U20S細胞死亡
權利要求
1.一種重組腺病毒,其中所述重組腺病毒是將人TMEM166基因的表達盒插入Ad5的基因組DNA中得到的重組腺病毒；所述人TMEM166基因的表達盒包括啟動子、人TMEM166的cDNA和終止子。
2.根據權利要求I所述的重組腺病毒，其特征在于所述人TMEM166基因的表達盒中，所述啟動子為CMV啟動子，所述終止子為SV40終止子。
3.根據權利要求I或2所述的重組腺病毒，其特征在于所述人TMEM166基因的表達盒還包括SV40polyA信號序列。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的重組腺病毒在誘導腫瘤細胞自噬和凋亡、抑制腫瘤細胞生長的藥物制備中的應用。
5.根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述腫瘤細胞為非實體瘤細胞。
6.根據權利要求5所述的用途，其特征在于所述腫瘤細胞為實體瘤細胞。
7.根據權利要求7所述的用途，其中所述的實體瘤細胞為骨肉瘤細胞、胃癌細胞以及食管癌細胞等。
8.根據權利要求5所述的用途，其中所述藥物與化療藥物聯合給藥來抑制腫瘤細胞生長。
9.根據權利要求9所述的用途，其中所述的化療藥物為3-甲基腺嘌呤(3-MA)和LY294002 等。
10.ー種藥物，其包含權利要求1-3中任一項所述的重組腺病毒。
全文摘要
本發明公開了一種重組腺病毒TMEM166作為基因治療藥物在抗腫瘤中的應用。本發明的重組腺病毒，是將人TMEM166基因的表達盒插入Ad5的基因組DNA中得到的重組腺病毒；所述人TMEM166基因的表達盒包括啟動子、人TMEM166的cDNA和終止子。本發明的重組腺病毒TMEM166在體內和體外實驗中均可明顯的誘導腫瘤細胞發生自噬和凋亡，抑制腫瘤細胞的生長。并且重組腺病毒TMEM166對腫瘤化療藥物有很好的協同作用，本發明的重組腺病毒TMEM166可廣泛用于多種腫瘤的基因治療。
文檔編號A61K48/00GK102851315SQ201110178440
公開日2013年1月2日 申請日期2011年6月29日 優先權日2011年6月29日
發明者馬大龍, 陳英玉, 常瑩, 許冬, 李艷軍, 郭金海, 王峰, 石太平 申請人:北京大學, 北京諾賽基因組研究中心有限公司