專利名稱：人αB-晶體蛋白在制備保護視網膜神經節細胞的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物制藥領域，特別是涉及到一種人α B-晶體蛋白在制備保護視網膜神經節細胞的藥物中的應用及藥物。
背景技術：
視神經損傷是臨床常見眼外傷類型和致盲原因。近年，隨著社會經濟發展，交通事故等外傷的增多，視神經損傷也明顯增多，在顱腦外傷患者中其發生率為6% 12.6%。傳統的觀點認為視神經損傷后發生不可逆的病理改變，神經組織不能再生，視功能損傷不能恢復。目前，尚無確切有效的治療手段。因此在視神經損傷后，及時采取有效的治療方法，保護和挽救視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells, RGCs)的存活和促進其軸突修復， 已成為目前研究的熱點。視神經損傷后難以再生的主要原因有損傷后視網膜神經節細胞(retinal ganglion cellsRGCs)的繼發性凋亡；失去靶細胞提供的營養物質；損傷局部膠質瘢痕的形成以及抑制性微環境的阻礙作用。為此，以往促進視神經再生研究主要集中在1)補充外源性神經營養因子。雖可一定程度保護RGCs存活，但作用短暫，多無促再生作用；2)干擾凋亡信號通路可減少RGCs發生凋亡，但并不能增強其軸突再生能力；3)用抗體或核酸干擾阻斷髓鞘抑制物的作用能促進RGCs軸突再生，但也只是短距離再生。此外，外周神經移植可促進視神經再生，但未能實現再生纖維與視中樞形成功能聯接。由此可見，目前的各種方法均不能達到神經纖維長距離有效的功能性再生。α B-晶體蛋白是α -晶體蛋白的一個亞基，Srivastava于2002年首次從晶 ^^1 ^(Srivastava OP, Srivastava K. Existence of deamidated
alphaB-crystal1 in fragm ents innormal and cataractous human lenses[J]. Mol Vis. 2003,9 :110-118.)。α B-晶體蛋白是小分子熱休克蛋白家族中的sHspB5，因此其具有小分子熱休克蛋白家族的共性，分子量小，大小約20KD，參與細胞的發育過程，并抵御多種因素引起的應激損傷和凋亡。不僅可以對變性神經組織有保護和促進修復作用， 還具有抑制炎癥、應激反應，維護細胞骨架蛋白和骨架網絡穩定性，及抵抗缺氧、高溫、反射線及藥物等因素誘導的細胞凋亡的作用。國內外的研究結果也顯示，αΒ-晶體蛋白與眼科青光眼視神經病變、視網膜撕裂、年齡相關性黃斑變性、視網膜缺血再灌注損傷， 視網膜營養不良、糖尿病視網膜病變等多種病變有關。而且，重組αΒ-晶體蛋白用于多發性硬化的治療，已在動物實驗中取得了良好的治療效果(Ousman SS, Tomooka BH, vanNoort JM et al. Protective and therapeutic role for alphaB-crystal1 in in autoimmunedemyelination[J], Nature. 2007,448(7152) :474-479)。近來研究發現既不在玻璃體腔注射神經營養因子，也不需髓鞘抑制物的中和抗體，晶狀體損傷后能顯著促進 RGCs的存活及軸突再生，并且再生軸突可達到上丘，形成功能性突觸聯系，這一保護作用顯著強于已知神經營養因子及中和髓鞘抑制物的作用，但尚不明確這種保護作用的機理及起保護作用的活性物質是什么。

發明內容
本發明根據上述領域的空白，提供一種保護視網膜神經節細胞的藥物。人α B-晶體蛋白在制備保護視網膜神經節細胞的藥物中的應用。所述保護視網膜神經節細胞的藥物，其特征在于其有效成分為分離純化的重組人α B-晶體蛋白，所述重組人α B-晶體蛋白的氨基酸序列如kq ID No. 1所示。所述藥物的劑型為注射劑。所述藥物的制備方法將分離純化的重組人α B-晶體蛋白溶于不影響α Β_晶體蛋白活性且適用于人體注射的溶劑中。所述溶劑的配方為20mM Tris-HCl, pH 7. 5，50mM氯化鈉，ImM EDTA，溶于無菌水中。所述重組人α B"晶體蛋白是人工構建的包含有如kq ID No. 2所示的核苷酸序列的重組表達載體在體外表達，然后經分離純化而得的重組蛋白。所述體外表達指將所述重組表達載體pET28a_a B-crystallin轉染到BL21細胞中，誘導陽性BL21細胞表達重組人aB-晶體蛋白。本發明基于發明人的發現人源a B晶體蛋白是晶體源性神經保護物質并能與視網膜神經節細胞胞膜結合，而且能拮抗髓鞘抑制物的阻礙作用促進RGCs突起的生長。發明人通過一序列動物模型試驗證明重組人a B-晶體蛋白在視神經損傷后對RCGs有明顯的保護作用，能夠明顯提高RGCs的存活率，促進RGCs突起的生長和受損的視神經軸突再生。根據這一系列試驗結果，本發明提出了重組人a B晶體蛋白在制備保護視網膜神經節細胞的藥物中的應用。這類藥物以人工表達的重組人aB晶體蛋白為有效成分，能夠對視網膜神經細胞的損傷提供有效的保護和恢復作用，促進視網膜神經節細胞細胞突起的生長和軸突再生。本發明的藥物，主要制備成注射劑，經靜脈給藥，注射劑的溶劑須是不影響a B-晶體蛋白活性，并適合人體注射兩個條件。人aB-晶體蛋白為已知蛋白，本領域技術人員基于對a B-晶體蛋白活性及保存條件的了解，可配制多種溶劑對有效成分重組人 a B-晶體蛋白進行溶解制備成本發明的藥物注射劑。本發明還提供了藥物的制備方法，主要步驟是體外制備重組人a B-晶體蛋白，然后溶于溶劑中。體外制備重組人aB-晶體蛋白，包括構建重組表達載體，轉染體外宿主細胞，培育細胞使其表達重組蛋白等步驟，aB-晶體蛋白可依照現有技術 (Ousman SS, Tomooka BH, vanNoort JM et al. Protective and therapeutic role for alphaB-crystallin in autoimmunedemyelination[J]. Nature. 2007,448(7152) 474-479)來操作。


圖1-1PCR擴增產物電泳圖，1 泳道DL2000DNA marker, 2 泳道PCR 產物圖 1-2 PMD19-T-α B-crystallin 酶切鑒定電泳圖，1 泳道:DNA ladder marker, 2 泳道:PMD 19_Τ_ α B-crystallin 酶切條帶
圖 1-3 pET32a- α B-crystal 1 in 酶切鑒定電泳圖，1 泳道DNA ladder marker, 2 泳道pET32a_ α B-crystalIin 酶切條帶圖1-6PCR擴增產物電泳圖1 泳道DNA ladder marker, 2 泳道PCR 產物圖 1-7 pET28a- α B-crystal 1 in 酶切鑒定電泳圖1 泳道DNA ladder marker, 2 泳道pEI^8a_ α B-crystalIin 酶切條帶圖 1-8 pET28a- α B-crystal Iin 質粒測序圖1-9重組蛋白SDS-PAGE分析1泳道蛋白分子量marker2-4泳道0. 4mM和0. 6mM濃度的IPTG下誘導的上清和沉淀圖1-10 (a)重組α B-晶體蛋白Q柱純化1-10 (b)層析過程中的α B-晶體蛋白SDS-PAGE1-3泳道上樣樣品、穿透、沉淀，4泳道蛋白分子量marker，5-9泳道純化過程中pl、p2、p3、p4、p5分別收集的純化蛋白圖1-11重組蛋白考馬斯亮藍染色1泳道蛋白分子量marker2泳道重組人aB-晶體蛋白；圖1-13重組人α Β_晶體蛋白肽質量指紋質譜鑒定蛋白評分圖1-14重組人α Β_晶體蛋白肽質量指紋質譜鑒定結果圖2-1實驗用Long Evans大鼠圖2-2實驗用中號無創血管鉗圖2-3大鼠尾靜脈注射圖2-4大鼠上丘和外側膝狀體定位圖2-5大鼠視網膜鋪片RGCs計數示意2-7正常組大鼠視網膜熒光金逆行標記的RGCs熒光金標記的正常RGCs細胞形態呈三角形(b圖粗箭頭)或圓形(b圖細箭頭)， 胞漿熒光均勻明亮。&(\100倍)，13(\400倍)圖2-8視神經損傷后2周，各組視網膜熒光金標記的RGCsa(l) :C 組(X200 倍):C 組(X400 倍)b(l) :S 組(X200 倍)；b(2) :S 組(X400 倍)圖2-9視神經損傷后4周，各組視網膜熒光金標記的RGCsa(l) :C 組(X200 倍):C 組(X400 倍)b(l) :S 組(X200 倍)；b(2) :S 組(X400 倍)
圖2-11正常大鼠β -IΙΙ-tubulin免疫熒光染色a(X200 倍)，b(X400 倍)圖2-12視神經鉗夾傷2周后，大鼠β -ΙΙΙ-tubulin免疫熒光染色a(l) :C 組(X 100 倍):C 組(X400 倍)b(l) :S 組(X 100 倍)；b(2) :S 組(X400 倍)圖2-13視神經損傷后4周，各組β ΙΙΙ-tubulin免疫熒光染色的RGCs
a(l) :C 組(X200 倍):C 組(X400 倍)b(l) :S 組(X200 倍)；b(2) :S 組(X400 倍)
具體實施例方式實施例1.人α B-晶體蛋白的制備一、質粒、菌株和細胞1.大腸桿菌 BL21(DE3)2. PMD19-T 載體(TAKARA 公司，日本)3. DH5 α 菌株、pET32a 質粒、pET28a 質粒(Novagen 公司，美國)二、主要酶和試劑1.逆轉錄試劑盒((Τ0Υ0Β0公司，日本)2. Luria-Bertani medium(Difco 公司，美國)3. KOD Plus DNA Polymerase (Τ0Υ0Β0 公司，日本)4.限制性內切酶 Nco、HindIII、EcoRI、XhoI (Τ0Υ0Β0 公司，日本)5. DNA 連接酶 solution I (TAKARA 公司，日本)6.多聚酶鏈反應(PCR)試劑Taq聚合酶(TAKARA公司，日本)
7. dNTPs (TAKARA 公司，日本)8. DNA marker (北京天根公司，中國)9. IPTG (Sigma 公司，美國)10. Trx and Trx antibody (R&D 公司，美國)13. a-crystalIin (Sigma 公司，美國)14. aB-crystallin antibody (&inta 公司，美國)15. Primers (Sangon ^W], ψ H )16. aB-crystallin (Cell Sciences)17. Tris堿(TBD生物技術發展中心，中國)18.甘氨酸(綠鳥科技發展有限公司，中國)19. SDS (TBD生物技術發展中心，中國)20.預染標準蛋白質marker (中山生物技術有限公司，中國)22.辣根酶標記的抗兔IgG(中山生物技術有限公司，中國)23.化學發光顯影劑(Pierce公司，美國)M.BCA法蛋白定量試劑盒(百泰克生物技術有限公司，中國)25.堿性磷酸酶標記山羊抗小鼠IgG(中山生物技術有限公司，中國)三、主要儀器1.超凈工作臺(蘇州集團安泰公司，中國)2.轉膜儀(杭州博日科技有限公司，中國)3·圖像分析儀(Leica公司，德國)
4.凝膠成像系統(BIV-RAD公司，美國)5.自動凝膠層析儀(MB99-2)(滬西分析儀器廠，中國)6.紫外可見分光光度計(Tu-1900)(北京普析通用儀器有限責任公司，中國)
四、主要配方Sterile filtered liquid in 20mM Tris-HCl, pH 7. 5+50mM NaCl+lmM EDTA1.磷酸緩沖液的配制(0. 05mol/L, pH6. 7)稱磷酸氫二鈉7. 7895g，磷酸二氫鈉 4. 407g溶于雙蒸水中，定容至1L，過濾去除雜質。2.電泳緩沖液的配制(5X) :Tris堿15. lg，SDS 5g，甘氨酸94g，加雙蒸水至 IOOOml 定容。3. 12% Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺電泳-分離膠的配制30%丙烯酰胺溶液 4. 0ml，10 % SDS 0. lml，10 % 過硫酸胺 0. lml，1. 5mmol/L Tris 2. 5ml (pH8. 8)，TEMED 0. 004ml，雙蒸水 3. 3ml，共 10ml。4.5% Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺電泳-積層膠的配制30%丙烯酰胺溶液 0. 83ml, 10% SDS 0. 05ml, 10%過硫酸胺 0. 05ml, 1. Ommo 1/L Tris 0. 63ml (pH 6. 8)，TEMED 0. 005ml，雙蒸水 3. 4ml，共 5ml。5. 10%過硫酸胺的配制過硫酸胺lg，加雙蒸水至IOml定容。6.上樣緩沖液的配制(2X)雙蒸水 5ml，0. lmol/L Tris-HCl (pH 6. 8)5ml,4% (w/v) SDS20ml,20% (v/v)甘油 10ml, 0. 2mol/L 2_b_ 巰基乙醇 0. 25g，0. 2% (w/v)溴酚藍 0. 08g。7.轉膜緩沖液甲醇 200ml，甘氨酸 2. 9g，SDSO. 37g，Tris5. 8g，雙蒸水 1000ml。8. TBST 緩沖液(PH7. 5) :Tween200. 5ml, NaC18. 76g, Tris6. 05g，雙蒸水 1000ml。五、實驗方法(一)人αB-晶體蛋白基因獲得在GenBank中檢索到人α B-晶體蛋白的序列為Seq ID NO. 1所示。根據大腸桿菌的密碼子使用偏好，將人α B-crystallin的氨基酸序列轉化DNA序列，人工合成cDNA序列。(二)目的基因的PCR擴增根據人α B-晶體蛋白的基因序列及pET3h載體的多克隆位點，采用I^rimer 5. 0 軟件設計擴增人α B-晶體蛋白基因的特異性引物。上游引物序列為5' -GGAATTGATCG CCATCCACCAC-3‘，下游引物序列為5' -CCGCTCGAGCTATTTCTTGGGGGCTGC GG-3‘。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，擴增片段長度為Μ^ρ。1、變性反應體系為
權利要求
1.人αB-晶體蛋白在制備保護視網膜神經節細胞的藥物中的應用。
2.保護視網膜神經節細胞的藥物，其特征在于其有效成分為分離純化的重組人 α B-晶體蛋白，所述重組人α B-晶體蛋白的氨基酸序列如kq ID No. 1所示。
3.根據權利要求1所述的藥物，劑型為注射劑。
4.根據權利要求3所述的藥物，所述注射劑所用的溶劑，pH7.5，配方為20!111 Tris-HCl、50mM 氯化鈉、ImMEDTA、無菌水。
5.根據權利要求3所述的藥物，所述重組人αΒ-晶體蛋白是人工構建的包含有如％(1 IDNo. 2所示的核苷酸序列的重組表達載體在體外表達，然后經分離純化而得的重組蛋白。
6.根據權利要求5所述的藥物，所述體外表達指將重組表達載體 pET28a-aB-crystallin轉染到BL21細胞中，誘導陽性BL21細胞表達重組人α B-晶體蛋白。
7.權利要求1 7任一所述的藥物的制備方法將分離純化的重組人αB-晶體蛋白溶于不影響α B-晶體蛋白活性且適用于人體注射的溶劑中。
8.根據權利要求7所述的制備方法，所述重組人αB-晶體蛋白是人工構建的包含有如 Seq IDNo. 2所示的核苷酸序列的重組表達載體在體外表達，然后經分離純化而得的重組蛋白。
9.根據權利要求8所述的制備方法，所述體外表達指將所述重組表達載體 pET28a-aB-crystallin轉染到BL21細胞中，誘導陽性BL21細胞表達重組人α B-晶體蛋白。
全文摘要
本發明“人αB-晶體蛋白在制備保護視網膜神經節細胞的藥物中的應用”，屬于生物制藥領域。所述保護視網膜神經節細胞的藥物，其特征在于其有效成分為分離純化的αB-晶體蛋白。本發明提供的藥物中的有效成分αB-晶體蛋白能夠顯著促進視網膜神經節細胞RGCs的存活及軸突再生，試驗證明，是一種對損傷后的視神經能起到恢復視功能的有效藥物。
文檔編號A61K9/08GK102210851SQ20111014497
公開日2011年10月12日 申請日期2011年5月31日 優先權日2011年5月31日
發明者吳楠, 應希, 王一, 王蕊, 黃小勇 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院