專利名稱：一種抗人源多藥耐藥蛋白Fab抗體及其制備方法
一種抗人源多藥耐藥蛋白Fab抗體及其制備方法技術領域
本發明屬于Fab抗體及其制備領域,特別涉及一種抗多藥耐藥蛋白Fab抗體及其制備方法。
背景技術：
腫瘤細胞的多藥耐藥性(mult1-drug resistance, MDR)多為獲得性耐藥，即在治療前對藥物敏感，治療后對藥物耐受。多藥耐藥性是指不僅對使用藥物產生耐受，而且對其他多種結構和作用機制完全不同的藥物產生交叉耐受。腫瘤細胞產生多藥耐藥性的最主要原因是瘤細胞膜過量表達一種ATP依賴性外排性泵，以減少化療藥物在細胞內部的積累。這種ATP依賴性外排性泵屬于ABC(ATP-binding cassette)轉運蛋白超家族,主要包括以下幾種(I)腫瘤多藥耐藥蛋白Ι/P-糖蛋白即為P-gp (Mult1-Drug Resistancel/ P-glycoprotein, MDRl/P-gp)也稱為 ABCBl (ATP-binding cassette BI)，它是 1976 年 Juliano等在耐藥的中國倉鼠卵巢癌細胞中發現的，隨后Roninson等獲得人耐藥KB癌細胞株的MDRl基因序列[1]，P-gp也是現在引起腫瘤多藥耐藥性最常見的原因。(2)多藥耐藥相關蛋白(3)乳癌耐藥蛋白(Breast cancer resistance protein, BCRP) (4)肺耐藥相關蛋白(Lung resistance related protein, LRP)。
P-gp是引起腫瘤細胞多藥耐藥性的最主要原因，由多藥耐藥蛋白基因 I (mult1-drug resistancel,mdrl)編碼為兩個完全相同的單體組成,每個單體含有一個七次跨膜疏水區和一個ATP結合區，兩個單體組合成一個能量依賴性泵位于細胞膜上。P-gp 在分解ATP供給能量的同時，可以將腫瘤細胞內部的親脂性化學藥物排到細胞外，因此一些親脂性藥物可以競爭性抑制P-gp外排化療藥物的功能。P-gp誘導的多藥耐藥腫瘤中同時檢測到高水平的蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)，PKC主要通過磷酸化P_gp藥物結合位點的絲氨酸而增強其外排化療藥物的功能。
第一代P-gp抑制劑為親脂性化合物，如維拉帕米、奎尼丁、環孢素A等，可作為 P-gp底物，與化療藥物競爭性或非競爭性結合P-gp，從而減少化療藥物外排。但是當它們的應用劑量達到抑制P-gp功能時有很強的毒副作用，這也限制了它們的臨床應用。接著第二代P-gp抑制劑出現，如PSC-833 (環孢素D衍生物)和Biricodar,它們與P-gp的親和力更強，并且沒有免疫抑制副作用；但是它們缺乏特異性，同樣抑制正常組織P-gp功能，而且還抑制細胞色素P450 3A的功能進而影響藥物代謝，因此它們的研發也受到限制。于是以tariquidar、0C144-093、zosuquidar、elacridar為代表的第三代P-gp抑制藥物應運而生，它們對P-gp親和力高，而且對依賴細胞色素P450 3A的藥物代謝影響很小，然而它們在達到抑制P-gp功能劑量時，仍有一定的細胞毒性，目前tariquidar、zosuquidar等第三代 P-gp抑制藥物還處于臨床試驗階段。
臨床腫瘤出現多 藥耐藥性多與P-gp有關，它已成為腫瘤化療的最主要障礙之一。 通過競爭性或非競爭性抑制P-gp功能，或者直接降低P-gp的表達是逆轉腫瘤多藥耐藥性的主要手段，隨著分子生物學技術的飛速發展，制備一種更特異的逆轉腫瘤多藥耐藥性的藥物，在保證化療藥物抑制腫瘤組織生長的同時對機體正常生理代謝的影響降到最低成為可能。單克隆抗體用于抑制腫瘤多藥耐藥性有很多優點如可以特異性的結合P-gp抗原表位，不會影響細胞色素P450 3A依賴的藥物代謝，小分子人源抗體在逆轉腫瘤多藥耐藥中， 既不會引起機體變態性免疫反應，又因為分子量小在體內代謝快，對正常組織細胞影響小， 有助于耐藥瘤細胞的化療等。但是，到目前為之還沒有抗P-gp單克隆抗體作為抑制腫瘤多藥耐藥的藥物。
噬菌體展示技術是將外源蛋白或多肽的基因序列插入到噬菌體結構基因的適當位置，并與結構基因融合表達于噬菌體外膜表面。現在噬菌體展示系統有多種，如絲狀噬菌體展示系統、λ噬菌體展示系統、Τ4噬菌體展示系統等。
絲狀噬菌體展示系統有很多種，Μ13絲狀噬菌體展示系統為其中一種，Μ13絲狀噬菌體展示系統中的Μ13噬菌體呈長絲狀，直徑6. 5nm，長約900nm，內含單鏈DNA基因組 (6，407個核苷酸)，被一層長圓柱狀核衣殼保護著，長圓柱狀核衣殼主要由gp8蛋白組成， 噬菌體的兩端為約3 5拷貝的gp3、gp6、gp7、gp9組成。M13噬菌體為溫和型噬菌體，感染萬.coli XLl-blue菌后，細菌生長緩慢，但不會導致細菌裂解，噬菌體以出芽的方式從宿主細胞中釋放。M13噬菌體展示系統也主要有2類(I)外源蛋白與主要核衣殼蛋白gp8融合表達，(2)外源蛋白與gp3蛋白融合表達。外源蛋白與gp8融合表達可以獲得高拷貝的外源蛋白，對外源蛋白起了放大作用，但過量的外源蛋白可能阻礙噬菌體再次侵染宿主菌，反而不利于淘選鑒定；外源蛋白與gp3蛋白融合表達，每個噬菌體攜帶有3 5拷貝的外源蛋白，對噬菌體結構影響較小，有利于應用到淘選鑒定中，獲得相對高親和力的抗體或受體。
噬菌體展示技術是一種將基因型和表型統一起來的基因工程技術，即淘選獲得目的蛋白的同時可得到該蛋白的基因序列。現在M13噬菌體展示技術系統須包括以下三個要素攜帶噬菌體結構蛋白基因(最常用gp3)的噬菌粒載體、輔助M13噬菌體、帶F性菌毛 E. coli。首先將目的基因片段克隆到噬菌粒載體上，并轉化進帶F性菌毛的疋coli宿主中；然后輔助M13噬菌體通過其一端由gp3、gp6、gp7組成的配體結構與宿主菌F性菌毛結合，逐漸將其基因組釋放到宿主菌中；噬菌體在宿主菌內復制，同時噬菌粒載體也表達與外源蛋白融合的噬菌體結構蛋白，噬菌體核衣殼便錯誤地將噬菌粒載體包裝進去，這種錯誤包裝的噬菌體可以再次感染疋宿主菌，但不能再次擴增出新的噬菌體。通過對釋放出的噬菌粒反復的“親和-洗脫-擴增”過程，最終獲得表達目的蛋白的基因克隆，即完成表型與基因型的統一。
現在M13噬菌體展示技術在淘選特異性的單克隆抗體得到廣泛的應用，近年來利用噬菌體展示技術已經成功制備了各種單鏈抗體、Fab抗體以及完整IgG抗體。噬菌體展示技術在制備淘選單克隆抗體方面相對于雜交瘤技術具有以下優點容易實現高通量淘選、 可以制備小分子量亞單位單克隆抗體、獲得的抗體克隆株更容易長期保存、易于實現大量生產等，因此噬菌體展示技術在單克隆抗體淘選和制備中引起重大變革。在構建M13噬菌體抗體庫過程中最常用到pComb3載體及XLl-blue宿主菌，pComb3載體具有氨節青霉素抗性并且含有兩個克隆位點位于gp3基因上游的IgG重鏈克隆位點和單獨的輕鏈克隆位點； XLl-blue宿主菌具有四環素抗性，本身具有F性菌毛，可被M13噬菌體感染。
M13噬菌體 展示技術操作簡便，常用于分子生物學研究中，它不僅可以進行高通量的抗體淘選，在研究蛋白質之間相互作用方面也有獨到的優勢，并且在以后研究藥物作用靶點、疾病的分子病理機制等方面將發揮越來越重要的作用。
通過競爭性或非競爭性抑制P-gp功能，或者直接降低P-gp的表達是逆轉腫瘤多藥耐藥性的主要手段，隨著分子生物學技術的飛速發展，利用M13噬菌體展示技術制備一種更特異的逆轉腫瘤多藥耐藥性的藥物，在保證化療藥物抑制腫瘤組織生長的同時對機體正常生理代謝的影響降到最低成為可能。發明內容
本發明的目的是提供一種利用M13噬菌體展示技術獲得特異性抗人P-gp跨膜區 (氨基酸784 968)的Fab抗體克隆，及其制備方法。本發明為監測因P_gp引起的腫瘤多藥耐藥的發生、研究P-gp跨膜區(氨基酸784 968)的功能以及制備抑制腫瘤多藥耐藥的抗體藥物提供可能。
本發明為人P-gp跨膜區氨基酸784 968的Fab抗體蛋白(以下簡稱為PFab29 抗體)，其輕鏈的基因序列具有SEQ ID No.1的序列，其輕鏈基因編碼的氨基酸序列具有SEQ ID No. 2的序列,其重鏈的基因序列具有SEQ ID No. 3的序列,其重鏈基因編碼的氣基酸序列具有SEQ ID No. 4的序列。
本發明PFab29抗體的制備方法如下(I)提取多藥耐藥人大腸癌組織總RNA并反轉錄為cDNA，設計引物，序列如下
權利要求
1.一種抗人源多藥耐藥蛋白Fab抗體，其特征在于基因全序列見序列表SEQ ID No. 1,3。
2.如權利要求1所述的序列，其特征在于輕鏈基因的序列全長為635bp，序列見序列表 SEQ ID No.1。
3.如權利要求2所述的序列，其特征在于輕鏈基因所編碼的多肽為211個氨基酸，見序列表 SEQ ID No. 2。
4.如權利要求1所述的序列，其特征在于重鏈基因的序列全長為696bp，序列見序列表 SEQ ID No. 3。
5.如權利要求4所述的序列，其特征在于重鏈鏈基因所編碼的多肽為232個氨基酸， 見序列表SEQ ID No. 4ο
6.—種權利要求1所述的抗人源多藥耐藥蛋白Fab抗體的制備方法如下(1)提取多藥耐藥人大腸癌組織總RNA并反轉錄為cDNA，設計引物，序列如下Sense primer CCGGAATTCCTCACCAAGCGGCTCCGAT ；Ant1-sense primer CCGCTCGAGGAGTTTATGTGCCACCAAGTAG ；上游(5'端)引物引入EcoR I酶切位點，下游(3'端)引物引入Xho I酶切位點，合成引物，利用設計引物PCR擴增目的基因片段JfpET28a(+)載體和P_gp784_968目的基因分別進行Xho I和EcoR I雙酶切，然后凝膠回收并定量；(2)pET28a(+)載體與P_gp784_968目的基因連接，熱激轉化BL21(DE3)感受態細胞涂布 LB/Kan (卡那霉素)平板，培養，提取質粒，然后進行Xho1、EcoR I雙酶切鑒定，選擇酶切結果陽性的克隆，測序，見序列表SEQ ID No. 5的序列；(3)取鑒定正確的陽性克隆P_gp784_968菌液，于LB/Kan液體培養基中培養，加入IPTG誘導表達，純化，得P_gP784-968蛋白，見序列表SEQ ID No. 6的序列，備用；(4)另取多藥耐藥性大腸癌病理組織，免疫小鼠，利用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定抗體滴度抗體滴度大于1:512，提取總RNA并在PCR儀上進行逆轉錄為cDNA ；以cDNA為模板， PCR法擴增引物，進行PCR，設計17條重鏈上游引物和5條重鏈下游引物及20條輕鏈上游引物及2條輕鏈下游引物，序列見SEQ ID No. 7-50，其中重鏈Y引物引入Xho I酶切位點3'引物引入Spe I酶切位點，輕鏈5'引物引入Sac I酶切位點，3'引物引入Xba I酶切位點；(5)將載體pComb3質粒與重鏈Fd段擴增產物分別進行Xho1、Spe I雙酶切并連接， 連接產物熱激轉化XLl-blue感受態細胞，得到重鏈Fd-pComb3庫質粒，將輕鏈擴增產物與 T載體連接，將連接產物熱激轉化TOPlO感受態細胞，得到輕鏈T-L庫質粒，重鏈Fd-pComb3 庫質粒與輕鏈T-L庫質粒分別進行Xba1、Sac I雙酶切，連接，連接產物熱激轉化至 XLl-blue感受態細胞，得到Fab抗體庫；(6)取Fab抗體庫，加入噬菌體VCSM13，振蕩培養，得到Fab噬菌體抗體庫，備用；(7)用純化后的P_gp784-968蛋白包被ELISA板，對Fab噬菌體抗體庫進行淘選，經過五輪淘選后，提取陽性克隆質粒，分別進行Xba I ,Sac I和Xho I ,Spe I雙酶切鑒定，得酶切鑒定后的Fab抗體克隆株；(8)取酶切鑒定后的Fab抗體克隆株，Fab抗體克隆株加入IPTG誘導表達，將表達產物分別以高表達P-gp的大腸癌組織勻漿液以及原核表達的P_gP784-968肽段為抗原行Elisa檢測，兩項檢測一致、讀值最高的克隆再行westernblot鑒定；提取雙重鑒定均為陽性的克隆株質粒，Spel/Nhel雙酶切后連接，重新轉熱激轉化XLl-blue感受態細胞，獲得鼠源抗人大腸癌P_gP784-968的Fab抗體克隆株PFab29，測序所表達的抗體為IgG2a亞型，見序列SEQ IDNo. 1，3。
7.權利要求1所述的抗人源多藥耐藥蛋白Fab抗體在制備抑制腫瘤多藥耐藥藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種抗人源多藥耐藥蛋白Fab抗體及其制備方法，屬于抗體及其制備領域；本發明為取多藥耐藥性大腸癌病理組織總RNA并逆轉錄為cDNA，利用本實驗室設計的特異性引物擴增出P-gp跨膜區(氨基酸784～968)基因片段，克隆至pET28a(+)載體并轉化E.coliBL21(DE3)，IPTG，30℃誘導表達，表達產物經鎳離子親和層析柱純化后WesternBlot鑒定。將純化的P-gp784-968蛋白作為抗原，對利用17條重鏈上游引物和5條重鏈下游引物；20條輕鏈上游引物及2條輕鏈下游引物，用原核表達的P-gp784-968肽段對pComb3載體的P-gpFab抗體庫進行五輪淘選，最終淘選所獲得的克隆進行雙酶切鑒定及IPTG誘導表達，表達產物通過ELISA及WesternBlot鑒定后獲得陽性克隆菌株，并測序，得PFab29。本發明為制備抑制腫瘤多藥耐藥的藥物提供可能。
文檔編號A61K39/395GK103044547SQ20121037925
公開日2013年4月17日 申請日期2012年10月9日 優先權日2012年10月9日
發明者張學梅, 張海玉, 王清, 李俊 申請人:大連大學