專利名稱：新方法
技術領域：
本發明涉及改進的用于生產亞微米水包油乳液的方法，具體地，涉及亞微米水包油乳液的過濾。
背景技術：
生產方法公開在0tt等人，2000 (The Adjuvant MF59: A 10-yearPerspective. Vaccine Adjuvants: Preparation methods and Research Protocols[Methods in Molecular medicine,第42卷，第 12章，第211-228頁]，Ott等人，1995(MF59 - Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines:Vaccine Design, the Subunit and Adjuvant Approach [Pharmaceutical Biotechnology第 6 卷]Powell 和 Newman 編，W006/100110A1,以及 Lidgate 等人，1992 (SterileFiltration of a Parenteral Emulsion. Pharmaceuticals Research 9(7): 860-863)。·水包油乳液可以作為佐劑用于疫苗/免疫原性組合物中。由于這些乳液被施用給人類，所述乳液必須是無菌的。用作佐劑的水包油乳液是亞微米乳液，且油微滴足夠小以穿過0. 2Mffl過濾器進行無菌過濾。本發明的一個目的是，提供一種用于生產亞微米水包油乳液的方法，尤其是水包油乳液的過濾。

發明內容
本發明涉及一種用于生產亞微米水包油乳液的方法，尤其是亞微米水包油乳液的過濾。本發明提供了用于生產亞微米水包油乳液的方法，所述方法包括下述步驟
a.制備亞微米水包油乳液；
b.通過無菌級過濾器，預過濾所述水包油乳液；
c.通過與步驟b)的過濾器分離的無菌級過濾器，過濾根據步驟b)濾過的水包油乳液。
具體實施例方式水包油乳液，尤其是亞微米水包油乳液，可以用作免疫學佐劑。腸胃外地施用包含與抗原(諸如流感抗原)相組合的所述水包油乳液的疫苗組合物，因而，所述水包油乳液必須是無菌的。本發明人已經證實，為了生產無菌的亞微米水包油乳液，通過單個無菌級過濾器過濾乳液是不夠的。本發明人已經證實，為了提供無菌的水包油乳液，在用無菌級過濾器過濾之前，必須預過濾水包油乳液。因此，本發明提供了一種用于生產亞微米水包油乳液的方法，所述方法包括下述步驟
a.制備亞微米水包油乳液；
b.通過無菌級過濾器，預過濾所述水包油乳液；C.通過與步驟b)的過濾器分離的無菌級過濾器，過濾根據步驟b)濾過的水包油乳液。在本發明的另一個實施方案中，提供了一種用于生產亞微米水包油乳液的方法，所述方法包括下述步驟
a.制備亞微米水包油乳液；
b.通過無菌級過濾器，預過濾所述水包油乳液；
c.通過與步驟b)的過濾器分離的過濾器，過濾根據步驟b)預濾過的水包油乳液；和
d.通過與步驟b)或c)的過濾器分離的無菌級過濾器，過濾根據步驟c)濾過的水包油乳液。 在該具體實施方案中，在步驟c)中使用的過濾器可以具有這樣的孔所述孔的大小范圍是從無菌級過濾器的孔徑(即約O. 至約2Mm的孔徑。具體地，在上述實施方案中在步驟c)中使用的過濾器的孔徑范圍是從無菌級過濾器的孔徑至約IMffl的大小。例如，在步驟b)中使用的過濾器的孔徑是約2Mm、約2. 5Mm、約IMm、約O. 9Mm、約O. 8Mm、約O. 9Mm、約 O. 7Mm、約 O. 6Mm、約 O. 5Mm、0. 45Mm 或無菌級,例如約 O. 2Mm,例如 O. 22Mm。亞微米水包油乳液是這樣的水包油乳液其中平均微滴尺寸小于lMm。測量微滴尺寸的方法是技術人員眾所周知的，例如動態光散射。通過本領域技術人員已知的方法，例如但不限于高壓勻漿化，例如使用微射流機，可以生產亞微米水包油乳液。在本發明的一個具體實施方案中，亞微米水包油乳液具有小于約220nm (O. 2Mm)、尤其是約120nm至約180nm的平均油微滴尺寸。“無菌級過濾器”是指，在大于或等于lxlOVcm2有效過濾面積的挑戰水平，用微生物挑戰以后，產生無菌流出液的過濾器。無菌級過濾器是本發明領域的技術人員眾所周知的，且具有約O. 2Mffl的孔徑，因而包括具有約O. 22ΜΠ1孔徑的過濾器。所述過濾器的膜可以由技術人員已知的任意合適的材料制成，例如，但不限于醋酸纖維素、聚醚砜(PES)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚四氟乙烯(PTFE)。在本發明的一個具體實施方案中，一個或多個或所有本發明的過濾器膜包含聚醚砜，例如親水性聚醚砜。在本發明的另一個實施方案中，提供了如本文所述的方法，所述方法包括步驟；
a.制備亞微米水包油乳液；
b.預過濾所述水包油乳液；
c.通過無菌級過濾器，過濾根據步驟b)預濾過的水包油乳液；
d.通過與步驟b)或步驟c)的過濾器分離的過濾器，過濾根據步驟c)濾過的水包油乳液；
e.通過與步驟b)、c)和/或d)的過濾器分離的無菌級過濾器，過濾根據步驟d)濾過的水包油乳液。在該具體實施方案中，在步驟b)和/或步驟d)中使用的過濾器可以具有這樣的孔所述孔的大小范圍是從無菌級過濾器(約O. 至約尤其是無菌級過濾器至約lMm。例如，在步驟b)和/或步驟d)中使用的過濾器的孔徑是約2Mm、約2. 5Mm、約lMm、約O. 9Mm、約 O. 8Mm、約 O. 9Mm、約 O. 7Mm、約 O. 6Mm、約 O. 5Mm、0. 45Mm 或無菌級，例如約 O. 2Mm,例如0.22Mm。在步驟b)和d)中使用的過濾器可以具有彼此相同的孔隙率，或具有彼此不同的孔徑。
在本發明的一個具體實施方案中，提供了本發明的方法，其中每個過濾器的分壓是約I至約I. 5巴，例如約I巴。在另一個實施方案中，提供了本發明的方法，其中在約15°C至約30°C、約16°C至約29°C、約17°C至約28°C、約16°C至約27°C、約16°C至約28°C、或22°C ±4°C的溫度進行過濾。在本發明的一個實施方案中，所述亞微米水包油乳液包含約2%至約15%、約4%至約12%的油、約5%至約10%、約4%至約6%、約8%至約12%、例如約5%或10% (v/v)的油。為了使任意水包油組合物適合對人施用，所述油相必須包含可代謝的油(即可生物降解的)。所述油可以是任意植物油、魚油、動物油或合成油，其對受體無毒，且能夠通過代謝進行轉化。堅果、種子和谷物是植物油的常見來源。合成油也是合適的。因此，本發明的水包油乳液包含可代謝的油，在一個具體實施方案中，本發明的水包油乳液包含角鯊烯(例如約4%至6% [v/V]) ο 本發明的水包油乳液還可以包含母育酚。母育酚是本領域眾所周知的，且描述在EP0382271中。具體地，所述母育酚是α -生育酚或其衍生物，諸如α -生育酚琥珀酸鹽(也稱作維生素E琥珀酸鹽)。在本發明的一個具體實施方案中，提供了包含角鯊烯(例如約5% [v/v])和α -生育酚(例如約5% [v/v])的本發明的水包油乳液。本發明的水包油乳液包含一種或多種表面活性劑。合適的表面活性劑是技術人員眾所周知的，包括但不限于聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80、聚山梨酯80)、脫水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)、磷脂酰膽堿(卵磷脂)、聚氧乙烯(12)鯨蠟硬脂酰醚和辛苯昔醇-9 (TRITON X-100)。在本發明的一個具體實施方案中，水包油乳液包含聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80、聚山梨酯80)。在另一個實施方案中，本發明的水包油乳液包含聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80)和其它表面活性劑，尤其是脫水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)。在本發明的一個具體實施方案中，所述水包油乳液包含可代謝的油(例如角鯊烯)、母育酚(例如α-生育酚)和表面活性劑(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯[吐溫80、聚山梨酯80])。在本發明的另一個實施方案中，本發明的水包油乳液包含可代謝的油(例如角鯊烯)、表面活性劑(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯[聚山梨酯80])和任選的第二種表面活性劑(例如脫水山梨糖醇三油酸酯[司盤85])。在本發明的另一個實施方案中，本發明的水包油乳液包含可代謝的油(例如角鯊烯)、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子表面活性劑(例如聚氧乙烯(12)鯨蠟硬脂酰醚)和疏水性非離子表面活性劑(例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯[(聚山梨酯80)])或脫水山梨糖醇三油酸酯[司盤85])。在本文中與本發明的“疫苗組合物”有關的實施方案也適用于與本發明的“免疫原性組合物”有關的實施方案，反之亦然。在每種情況下，發明人在本文中意圖任選地用術語“由……組成”、“由……構成”分別替代術語“包含”、“包括”。與數字值ζ有關的術語“約”是指ζ±5%或10%。實施例方法
乳化方法
通過混合注射用水、磷酸鹽緩沖鹽水和吐溫，在罐2中制備水相。通過混合生育酚和角鯊烯，在罐I中制備油相。攪拌兩相，直到得到均質。用氮沖洗整個裝置，以避免生育酚氧化。用膜泵給高壓勻漿器供料。以需要的流量比，一起進料兩相。使兩相第I次穿過高剪切勻漿器，在這里得到粗乳液。然后，與高剪切勻漿器連通地，產物進入高壓勻漿器，在這里得到細乳液。在混合裝置的出口處，將產物收獲在罐3中(第I次穿過)。當罐2和I空時，將·來自罐3的乳液導向混合裝置的入口，進行第2次穿過。在第2次穿過結束時，將產物收獲在罐2中。當罐3空時，將來自罐2的乳液導向混合裝置的入口，進行第3次穿過。將乳液收犾在te 3中，并在過濾以如在氣下保減。過濾方法
在I巴最大壓力，在18-26°C之間的溫度，在包含組合的O. 5/0. 2Mm膜的2個除菌過濾器上進行過濾，持續最大3小時的接觸時間。為了證實過濾方法的效率，必須以IO7 CFU/cm2膜的濃度，用懸浮在乳液中的缺陷短波單胞菌(漢i/iffii/wte)挑戰所述過濾器膜。為了找到最佳構造，測試了幾種裝置。在第一種裝置中，以IO7 CFU /cm2膜的濃度，給所述產品接種缺陷短波單胞菌細菌，并在I巴最大壓力，在18-26°C之間的溫度，在2個O. 5/0. 2Mm過濾器上進行過濾。接種的產品和過濾器之間的接觸時間最大為3小時。或者，首先在O. 5Mm平膜上預濾所述產品。然后以IO7 CFU /cm2膜的濃度，給所述產品接種缺陷短波單胞菌細菌，并在I巴最大壓力，在18-26°C之間的溫度，在O. 2Mm或
O.5/0. 2Mm或O. 2/0. 2Mm平膜上進行過濾。接種的產品和過濾器之間的接觸時間最大為I. 5小時。最后，首先在含有O. 5和O. 2Mm過濾器的封裝體(capsule)上預濾所述產品。然后以IO7 CFU /cm2膜的濃度，給所述產品接種缺陷短波單胞菌細菌，并在I巴最大壓力，在18-26°C之間的溫度，在O. 2Mm封裝體上進行過濾。接種的產品和過濾器之間的接觸時間最大為3小時。在所有情況下，在最后一個除菌膜之后收獲濾液，并在O. 45Mffl收集過濾器上過濾整個體積，以便鑒別缺陷短波單胞菌的存在。將O. 45Mm過濾器鋪在TSA板上，并在30°C溫育7天。然后在第2、3、4和7天目檢該板。如果觀察到菌落，對它們計數并鑒別。結果
在沒有預濾或使用O. 5Mm預濾的情況下，在堵塞之前穿過過濾器的體積小于達到19.14 ml/cm2 (滿足IO7 CFU/cm2的BCT要求所需)的目標保留體積所需的最小保留體積。當使用含有O. 5/0. 2膜的封裝體作為預濾器進行預濾時，保留體積增加至最多19. 4 ml/cm2,且根本沒有觀察到傳代(passage)。
權利要求
1.一種用于生產亞微米水包油乳液的方法，所述方法包括下述步驟 a.制備亞微米水包油乳液； b.通過無菌級過濾器，預過濾所述水包油乳液； c.通過與步驟b)的過濾器分離的無菌級過濾器，過濾根據步驟b)濾過的水包油乳液。
2.如權利要求I所述的方法，所述方法包括步驟 a.制備亞微米水包油乳液； b.通過無菌級過濾器，預過濾所述水包油乳液； c.通過與步驟b)的過濾器分離的過濾器，過濾根據步驟b)預濾過的水包油乳液；和 d.通過與步驟b)或c)的過濾器分離的過濾器，過濾根據步驟c)濾過的水包油乳液。
3.根據權利要求2所述的方法，所述方法包括步驟； a.制備亞微米水包油乳液； b.預過濾所述水包油乳液； c.通過無菌級過濾器，過濾根據步驟b)預濾過的水包油乳液； d.通過與步驟b)或步驟c)的過濾器分離的過濾器，過濾根據步驟c)濾過的水包油乳液； e.通過與步驟b)、c)和/或d)的過濾器分離的無菌級過濾器，過濾根據步驟d)濾過的水包油乳液。
4.根據任一項前述權利要求所述的方法，其中一個或多個過濾器膜包含聚醚砜，例如親水性聚醚砜。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述無菌級過濾器具有約O.2Mm、例如O. 22Mm的孔徑。
6.根據權利要求2、4或5中任一項所述的方法，其中在步驟c)中使用的過濾器具有下述孔徑無菌級至約2Mm,例如約2Mm、約I. 5Mm、約IMm、約O. 9Mm、約O. 8Mm、約O. 9Mm、約.O. 7Mm、約 O. 6Mm、約 O. 5Mm、0. 45Mm 或無菌級，例如約 O. 2Mm,例如 O. 22Mm。
7.根據權利要求3-5中任一項所述的方法，其中在步驟b)和/或步驟d)中使用的過濾器可具有下述孔徑無菌級過濾器(約O. 至約2Mm，尤其是無菌級過濾器至約lMffl，例如，約 2Mm、約 2. 5Mm、約 I Mm、約 O. 9Mm、約 O. 8Mm、約 O. 9μηι、約 O. 7Mm、約 O. 6Mm、約 O. 5Mm、.O. 45Mm或無菌級,例如約O. 2Mm,例如O. 22Mm。
8.根據任一項前述權利要求所述的方法，其中每個過濾器的分壓是約I至約I.5巴，例如約I巴。
9.根據任一項前述權利要求所述的方法，其中在15°C至30°C、16°C至29°C、17°C至28°C、16°C至 27°C、16°C至 28°C、或約 22°C ±4°C進行過濾。
10.根據任一項前述權利要求所述的方法，其中所述水包油乳液包含2%至15%(v/v)的油。
11.根據權利要求所述的方法，其中所述亞微米水包油乳液包含4%至6%(v/v)的油。
12.根據任一項前述權利要求所述的方法，其中所述水包油乳液包含8-12%(v/v)的油。
13.根據任一項前述權利要求所述的方法，其中所述亞微米水包油乳液包含角鯊烯和一種或多種表面活性劑。
14.根據權利要求中任一項所述的方法，其中所述亞微米水包油乳液包含角鯊烯、母育酚和表面活性劑。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述母育酚是α-生育酚。
16.根據權利要求13-15中任一項所述的方法，其中所述表面活性劑是聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80/聚山梨酯80)。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述亞微米水包油乳液包含角鯊烯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80)和脫水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)。
18.根據權利要求13所述的方法，其中所述亞微米水包油乳液包含角鯊烯、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子表面活性劑和疏水性非離子表面活性劑。
全文摘要
本發明提供了用于生產亞微米水包油乳液的方法，所述方法包括下述步驟a.制備亞微米水包油乳液；b.通過無菌級過濾器，預過濾所述水包油乳液；c.通過與步驟b)的過濾器分離的無菌級過濾器，過濾根據步驟b)濾過的水包油乳液。
文檔編號A61K47/22GK102917688SQ201180028503
公開日2013年2月6日 申請日期2011年6月8日 優先權日2010年6月10日
發明者V.德庫佩雷, V.曼庫索 申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司