專利名稱：包含顆粒佐劑和免疫增強(qiáng)劑組合的流感疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于用佐劑配制疫苗來提供保護(hù)以抵御流感病毒感染的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
除了希龍疫苗公司(Chiron Vaccines)的FLUAD 產(chǎn)品利用MF59水包油乳液佐劑 外[1]，目前常規(guī)使用的流感疫苗不包含佐劑。參考文獻(xiàn)2的第17和18章詳細(xì)描述了這些疫苗。它們基于活病毒或滅活的病毒，滅活疫苗可以基于完整的病毒、“裂解”病毒或純化的表面抗原(包括血凝素和神經(jīng)氨酸酶)。血凝素(HA)是滅活流感疫苗的主要免疫原，參考HA水平標(biāo)準(zhǔn)化疫苗劑量，疫苗通常含有約15 μ gHA/毒株。流感爆發(fā)期需要大量流感疫苗，但難以增加疫苗供應(yīng)從而滿足巨大的需求。因此，除了生產(chǎn)更多疫苗抗原，有人提出可以使用較低含量的抗原/毒株，同時(shí)使用佐劑來彌補(bǔ)減少的抗原劑量。還有人提出在流行間期采用相同的方案，從而例如能覆蓋更多人群而無需提聞生廣水平。有人提示可用不可溶的顆粒佐劑[3]，例如鋁鹽[4-7]或微粒[8]改進(jìn)流感疫苗。雖然這些佐劑配制的疫苗是有用的，但仍有提高的空間。因此，本發(fā)明的目的是提供佐劑配制的其它改進(jìn)流感疫苗(對于流行期和流行間期使用)和它們的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)含有不可溶顆粒佐劑的流感疫苗能引發(fā)IgG應(yīng)答，主要是TH2應(yīng)答(IgGl)。通過在組合物中加入免疫增強(qiáng)劑可將該應(yīng)答改變?yōu)門Hl應(yīng)答(IgG2a)。據(jù)報(bào)道，THl型應(yīng)答[9]能提高針對流感病毒的異源亞型(heterosubtypic)免疫力。有利的是，還發(fā)現(xiàn)免疫增強(qiáng)劑能提高血凝素滴度和抗-血凝素ELISA滴度。因此，本發(fā)明提供包含⑴流感病毒抗原；(ii)不可溶的顆粒佐劑；和(iii)免疫增強(qiáng)劑的免疫原性組合物。本發(fā)明還提供制備免疫原性組合物的方法，其包括混合(i)流感病毒抗原；(ii)不可溶的顆粒佐劑；和(iii)免疫增強(qiáng)劑的步驟。本發(fā)明提供裝有以下組分的試劑盒(i)包含流感病毒抗原的第一試劑盒組分；和(ii)包含不可溶顆粒佐劑的第二試劑盒組分，其中(a)所述第一和第二組分包含免疫增強(qiáng)劑，或(b)所述試劑盒裝有包含免疫增強(qiáng)劑的第三試劑盒組分。流感病毒抗原本發(fā)明組合物包含流感病毒抗原。通常可從流感病毒顆粒制備這些抗原，或者可在重組宿主(例如，利用桿狀病毒載體的昆蟲細(xì)胞)中表達(dá)諸如血凝素等抗原并以純化形式使用[10、11]。然而,抗原一般來自病毒顆粒。
抗原可采用活病毒，或者更優(yōu)選滅活病毒的形式。滅活病毒的化學(xué)方法包括用有效量的一種或多種以下試劑處理洗滌劑、甲醛、福爾馬林、β_丙內(nèi)酯或紫外光。滅活的其它化學(xué)方法包括用亞甲基藍(lán)、補(bǔ)骨脂素、羧基富勒烯(C60)或它們?nèi)魏蔚慕M合處理。本領(lǐng)域知道滅活病毒的其它方法，例如二元乙胺(binary ethylamine)、乙酰基乙烯亞胺或Y射線。INFLEXAL 產(chǎn)品是完整的病毒顆粒滅活疫苗。如果使用滅活病毒，疫苗可包含完整的病毒、裂解病毒或純化的表面抗原(包含血凝素，通常還包含神經(jīng)氨酸酶)。可通過各種方法 從含病毒的液體收集病毒顆粒。例如，純化方法可包括利用線性蔗糖梯度溶液的區(qū)帶離心，所述蔗糖溶液含有洗滌劑以使病毒顆粒破裂。任選稀釋后，可通過滲濾純化抗原。用洗滌劑(例如，乙醚、聚山梨醇酯80、脫氧膽酸鹽、磷酸三-N-丁酯、曲通X-100、曲通N101、溴化十六烷基三甲銨、Tergitol NP9，等等)處理病毒顆粒，包括“吐溫-醚”裂解方法來產(chǎn)生亞病毒顆粒制品，從而獲得了裂解病毒。本領(lǐng)域熟知裂解流感病毒的方法，例如參見參考文獻(xiàn)12-17等。通常利用破裂濃度(disrupting concentration)的裂解劑(splitting agent)使感染性或非感染性的完整病毒破裂或破碎來進(jìn)行病毒的裂解。破裂造成病毒蛋白質(zhì)完全或部分溶解，從而改變了病毒的完整性。優(yōu)選的裂解劑是非離子和離子性(例如，陽離子)表面活性劑，例如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜堿、甜菜堿、聚氧乙烯烷基醚、N, N- 二烷基-葡糖酰胺(Glucamides)、海克麥格(Hecameg)、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季銨化合物、十二烷基肌氨酸鈉、CTAB(溴化十六烷基三甲銨)、磷酸三丁酯(tri-N-butyl-phosphate)、塞太弗倫(Cetavlon)、肉豆蘧基三甲基銨鹽、脂轉(zhuǎn)染試劑、脂轉(zhuǎn)染胺、DOT-ΜΑ、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如，曲通表面活性劑，如曲通X-100或曲通N101)、聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(吐溫表面活性劑)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一種有用的裂解方法利用脫氧膽酸鈉和甲醛的連續(xù)作用，裂解發(fā)生在最初的病毒顆粒純化期間(例如，在蔗糖密度梯度溶液中)。因此裂解方法可包括使含病毒顆粒的物質(zhì)澄清(以除去非病毒顆粒物質(zhì))，濃縮收集的病毒顆粒(例如，采用吸附法，如CaHPO4吸附)，分離完整病毒顆粒與非病毒顆粒物質(zhì)，在密度梯度離心步驟中利用裂解劑裂解病毒顆粒(例如，利用含有裂解劑，如脫氧膽酸鈉的蔗糖梯度(溶液))，然后過濾(例如，超濾)以除去不需要的物質(zhì)。可將裂解的病毒顆粒有用地重懸在磷酸鈉緩沖的等滲氯化鈉溶液中。BEGRIVAC 、FLUARIX 、FLUZ0NE 和 FLUSHIELD 產(chǎn)品是裂解疫苗(split vaccine)。純化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，通常還包含神經(jīng)氨酸酶。本領(lǐng)域熟知制備純化形式的這些蛋白質(zhì)的方法。FLUVIRIN 、AGRIPPAL 和INFLUVAC 產(chǎn)品是亞單位疫苗。流感抗原還可以病毒體形式存在[18]。流感病毒可以是減毒的。流感病毒可以對溫度敏感。流感病毒可以是冷適應(yīng)的。這三種可能性特別適用于活病毒。用于疫苗中的流感病毒毒 株每季不同。在目前的流行間期，疫苗通常包含兩種甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一種乙型流感毒株，一般是三價(jià)疫苗。本發(fā)明還可利用流行毒株(即，對疫苗受者和普通人群而言免疫原初的毒株)的病毒，例如H2、H5、H7或H9亞型毒株(特別是甲型流感病毒)，流行毒株的流感疫苗可以是單價(jià)疫苗，或者可以添加了流行毒株的普通三價(jià)疫苗為基礎(chǔ)。然而，取決于季節(jié)和疫苗所含抗原的性質(zhì)，本發(fā)明可起保護(hù)作用以抵御以下一種或多種甲型流感病毒血凝素亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。本發(fā)明可起保護(hù)作用以抵御以下一種或多種甲型流感病毒NA 亞型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8 或 N9。可有用地包含在組合物中的其它毒株是耐受抗病毒治療的毒株(例如，耐受奧塞米韋[19]和/或扎那米韋)的毒株，包括耐藥性流行毒株[20]。本發(fā)明的佐劑配制的組合物特別可用于免疫接種以抵御流行毒株。能導(dǎo)致流行病爆發(fā)的流感毒株的特征在于(a)與目前流行的人毒株中的血凝素相比，其含有新的血凝素，即，未在人群中出現(xiàn)超過10年的毒株(例如，H2)，或者以前根本未在人群中見到的毒株(例如，通常只在鳥群中發(fā)現(xiàn)的H5、H6或H9)，從而使得人群對該毒株的血凝素而言在免疫學(xué)上是原初的；(b)其能在人群中水平轉(zhuǎn)移；和(c)其對人具有致病性。對于免疫接種抵御流行性流感，優(yōu)選具有H5血凝素類型的毒株，例如H5N1毒株。其它可能的毒株包括H5N3、 H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，及任何其它可能出現(xiàn)的流行毒株。在H5亞型內(nèi)，病毒可能屬于HA進(jìn)化枝I、HA進(jìn)化枝I’、HA進(jìn)化枝2或HA進(jìn)化枝3 [21]，其中進(jìn)化枝I和3特別相關(guān)。本發(fā)明組合物可包含一種或多種(例如，1、2、3、4或更多種)流感病毒毒株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原。如果疫苗包含多種流感毒株，通常分別培養(yǎng)不同的毒株，收集病毒后混合來制備抗原。因此，本發(fā)明方法可包括混合多種流感毒株的抗原的步驟。流感病毒可以是重配毒株，可通過反向遺傳學(xué)技術(shù)獲得。反向遺傳學(xué)技術(shù)[例如，22-26]能利用質(zhì)粒在體外制備含所需基因組區(qū)段的流感病毒。該技術(shù)通常涉及表達(dá)(a)例如能從poll啟動子編碼所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)例如能從polll啟動子編碼病毒蛋白質(zhì)的DNA分子，從而使得在細(xì)胞中表達(dá)兩種類型的DNA能裝配完整的感染性病毒顆粒。DNA優(yōu)選能提供所有病毒RNA和蛋白質(zhì)，但也可能利用輔助病毒提供所述RNA和蛋白質(zhì)中的一些。優(yōu)選質(zhì)粒方法，從而能用不同質(zhì)粒產(chǎn)生各病毒RNA [27-29]，這些方法還包括利用質(zhì)粒來表達(dá)所有病毒蛋白質(zhì)或其中一些(例如，PB1、PB2、PA和NP蛋白質(zhì))，一些方法利用了 12種質(zhì)粒。為減少所需的質(zhì)粒數(shù)，最近的方法[30]在同一質(zhì)粒上組合了多個(gè)RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄盒(對于病毒RNA合成)(例如，編碼1、2、3、4、5、6、7或所有8個(gè)甲型流感vRNA區(qū)段的序列)，在另一質(zhì)粒上組合了含RNA聚合酶II啟動子的多個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)(例如，編碼I、2、3、4、5、6、7或所有8個(gè)甲型流感mRNA轉(zhuǎn)錄物的序列)。參考文獻(xiàn)30所述方法的優(yōu)選方面包括(a) —個(gè)質(zhì)粒上的PBl、PB2和PA mRNA編碼區(qū)；和(b) 一個(gè)質(zhì)粒上的所有8個(gè)vRNA編碼區(qū)段。包含一個(gè)質(zhì)粒上的NA和HA區(qū)段和另一質(zhì)粒上的6個(gè)其它區(qū)段也是有利的。除了用poll啟動子編碼病毒RNA區(qū)段，還可能用細(xì)菌噬菌體聚合酶啟動子[31]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的啟動子。由于poll啟動子的種類特異性，細(xì)菌噬菌體聚合酶啟動子對于許多細(xì)胞類型(例如，MDCK)更方便，雖然還必須用編碼外源性聚合酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。其它技術(shù)可能采用雙重poll和polll啟動子來同時(shí)編碼一個(gè)模板的病毒RNA和可表達(dá)的mRNA [32、33]。因此，甲型流感病毒可包含A/PR/8/34病毒的一個(gè)或多個(gè)RNA區(qū)段(通常是A/PR/8/34的6個(gè)區(qū)段，其中HA和N區(qū)段來自疫苗毒株，即6:2重配株)，特別是用卵培養(yǎng)病毒時(shí)。還可包含用于生產(chǎn)疫苗制備用重配病毒的A/WSN/33病毒或任何其它病毒毒株的一個(gè)或多個(gè)RNA區(qū)段。通常，本發(fā)明保護(hù)抵御能人向人傳播的毒株，因此毒株的基因組一般包含源自哺乳動物(例如人)流感病毒的至少一個(gè)RNA區(qū)段。其可包含源自禽流感病毒的NS區(qū)段。可用卵(通常是SPF卵)或細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)用作抗原來源的病毒。目前培養(yǎng)流感病毒的標(biāo)準(zhǔn)方法利用含胚的雞蛋以及從雞蛋內(nèi)含物(尿囊液)中純化病毒。然而，近年來用動物細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)病毒，出于速度和患者變態(tài)反應(yīng)的原因，優(yōu)選該培養(yǎng)方法。如果采用雞蛋培養(yǎng)病毒，貝1J可將病毒與一種或多種氨基酸一起引入雞蛋的尿囊液中[15]。細(xì)胞物質(zhì)通常是哺乳動物細(xì)胞系。合適的哺乳動物細(xì)胞來源包括但不限于倉鼠、牛、靈長類(包括人和猴)和犬細(xì)胞。可利用各種細(xì)胞類型，例如腎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、肺細(xì)胞等。合適的倉鼠細(xì)胞的例子是名為BHK21或HKCC的細(xì)胞系。合適的猴細(xì)胞是，例如非洲綠猴細(xì)胞，例如VeiO細(xì)胞系中的腎細(xì)胞。合適的犬細(xì)胞是，例如MDCK細(xì)胞系中的腎細(xì)胞。因此，合適的細(xì)胞系包括但不限于MDCK ；CH0 ；293T ；BHK ；Vero ;MRC_5 ；PER. C6 ；WI-38 ;等等。用于培養(yǎng)流感病毒的優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞系包括源自馬-達(dá)二氏犬腎的MDCK細(xì)胞[34-37];源自非洲綠猴(Cercopithecus aethiops)腎臟的Vero細(xì)胞[38-40];或源自人胚胎成視網(wǎng)膜細(xì)胞的PER. C6細(xì)胞[41]。這些細(xì)胞系可廣泛購自，例如美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC) [42]、寇里爾細(xì)胞保藏中心(Coriell Cell Repositories) [43]或歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏所(ECACC)。例如，ATCC提供目錄號為CCL-81、CCL-81. 2、CRL_1586和CRL-1587的各種不同Vero細(xì)胞，目錄號為CCL-34的MDCK細(xì)胞。PER. C6可以保藏號96022940購自ECACC0作為哺乳動物細(xì)胞系的次選替代，可用禽細(xì)胞系培養(yǎng)病毒[例如，參考文獻(xiàn)44-46]，包括源自鴨(例如，鴨視網(wǎng)膜)或母雞的細(xì)胞系，例如雞胚胎干細(xì)胞(CEF)，等等。離子包括禽胚胎干細(xì)胞[44、47]，包括源自雞胚胎干細(xì)胞的EBx細(xì)胞系、EB45、EB14和EB14-074 [48]。如果利用哺乳動物細(xì)胞系培養(yǎng)病毒，則組合物優(yōu)選不含卵蛋白質(zhì)(例如，卵白蛋白和卵類黏蛋白)和雞DNA，從而能降低變應(yīng)原性。培養(yǎng)流感病毒的最優(yōu)選細(xì)胞系是MDCK細(xì)胞系。原始MDCK細(xì)胞系可以CCL-34購自ATCC，但也可使用該細(xì)胞系的衍生物。例如，參考文獻(xiàn)34披露了適應(yīng)于在懸浮培養(yǎng)基中生長的MDCK細(xì)胞系(“MDCK 33016”，以DSMACC2219保藏)。類似地，參考文獻(xiàn)49披露了生長在無血清培養(yǎng)懸液中的MDCK衍生細(xì)胞系(“B-702”，以FERM BP-7449保藏)。參考文獻(xiàn) 50 披露了非致瘤性 MDCK 細(xì)胞，包括“MDCK-S” (ATCC PTA-6500)、“MDCK-SF101” (ATCCPTA-6501)、“MDCK-SF102” (ATCC PTA-6502)和“MDCK-SF103”(PTA-6503)。參考文獻(xiàn) 51 披露了對感染高度敏感的MDCK細(xì)胞系，包括“MDCK. 5F1”細(xì)胞(ATCC CRL-12042)。可使用任何這些MDCK細(xì)胞系。如果用細(xì)胞系培養(yǎng)病毒，則生長培養(yǎng)基以及用于啟動培養(yǎng)的病毒接種物優(yōu)選不含(即，經(jīng)測試得到污染的陰性結(jié)果)單純皰疹病毒、呼吸道合胞體病毒、副流感病毒3、SARS冠狀病毒、腺病毒、鼻病毒、呼腸病毒、多瘤病毒、雙RNA病毒、環(huán)病毒和/或細(xì)小病毒[52]。特別優(yōu)選不含單純皰疹病毒。如果用細(xì)胞系培養(yǎng)病毒，則每劑組合物優(yōu)選含有少于IOng (優(yōu)選少于lng，更優(yōu)選少于IOOpg)的殘留宿主細(xì)胞DNA，雖然可以存在痕量的宿主細(xì)胞DNA。總之，本發(fā)明組合物中的宿主細(xì)胞DNA不能長于IOObp。現(xiàn)在，檢測殘留的宿主細(xì)胞DNA是生物制品的常規(guī)要求，屬于技術(shù)人員的普通能力。用于檢測DNA的試驗(yàn)通常是確認(rèn)試驗(yàn)[53、54]。可利用數(shù)學(xué)和可定量的術(shù)語描述確認(rèn)試驗(yàn)的性能特征，已鑒定了其可能的誤差來源。已總體上檢驗(yàn)了該試驗(yàn)的諸如準(zhǔn)確度、精密度、特異性等特征。一旦校驗(yàn)(例如，用已知標(biāo)準(zhǔn)量的宿主細(xì)胞DNA)及檢驗(yàn)好某試驗(yàn)，可常規(guī)進(jìn)行定量DNA檢測。可采用三種主要的DNA定量技術(shù)雜交方法,例如Sourthern印跡或槽印跡[55];免疫測定方法，例如Threshold 系統(tǒng)[56];和定量PCR[57]。技術(shù)人員熟知這些方法，雖然各方法的精確特征取決于所研究的宿主細(xì)胞，例如雜交探針的選擇，擴(kuò)增用引物和/或探針的選擇，等等。分子裝置公司(Molecular Devices)的Threshold 系統(tǒng)是用于皮克水平總DNA的定量試驗(yàn)，其已用于監(jiān)測生物藥品中的污染DNA水平[56]。典型的試驗(yàn)包括在生物素化的ssDNA結(jié)合蛋白、脲酶偶聯(lián)的抗-ssDNA抗體和DNA之間非序列特異性地形成反應(yīng)復(fù)合物。所有試驗(yàn)組分均裝入購自生產(chǎn)商的完整的總DNA測定試劑盒(TotalDNA Assay Kit)中。各種商品化生產(chǎn)商提供檢測殘留宿主細(xì)胞DNA的定量PCR試驗(yàn)，例如 AppTec 實(shí)驗(yàn)室服務(wù)公司(AppTec Laboratory Services)、BioReliance 、亞瑟技術(shù)公司(Althea Technologies)，等等。檢測人病毒疫苗中宿主細(xì)胞DNA污染的化學(xué)發(fā)光雜交試驗(yàn)和總DNA Threshold 系統(tǒng)的比較見參考文獻(xiàn)58。可采用標(biāo)準(zhǔn)純化方法，例如層析等在疫苗制備期間除去污染性DNA。通過核酸酶處理，例如用DNA酶可促進(jìn)除去殘留的宿主細(xì)胞DNA。參考文獻(xiàn)59和60披露了減少宿主細(xì)胞DNA污染的便利方法，其涉及兩步處理，首先可在病毒培養(yǎng)期間使用DNA酶(例如，Benzonase)，然后可在病毒顆粒破裂期間使用陽離子洗滌劑(例如，CTAB)。用烷化劑，例如β -丙內(nèi)酯處理也可用于除去宿主細(xì)胞DNA，該方法還可優(yōu)選用于滅活病毒顆粒[61]。
優(yōu)選在每15yg血凝素中含有<10ng (例如，<lng、〈100pg)宿主細(xì)胞DNA的疫苗，例如每O. 25ml體積含有<10ng(例如，〈lng、〈lOOpg)宿主細(xì)胞DNA的疫苗。更優(yōu)選在每50 μ g血凝素中含有<10ng(例如，〈lng、〈lOOpg)宿主細(xì)胞DNA的疫苗，例如每O. 5ml體積含有<10ng(例如，〈lng、〈lOOpg)宿主細(xì)胞DNA的疫苗。優(yōu)選任何殘留宿主細(xì)胞DNA的平均長度短于500bp，例如短于400bp、短于300bp、短于200bp、短于IOObp,等等。對于用細(xì)胞系，例如MDCK細(xì)胞培養(yǎng)，可用懸液培養(yǎng)[34、62、63]或貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞來培養(yǎng)病毒。用于懸液培養(yǎng)的一種合適的MDCK細(xì)胞系是MDCK 33016(保藏號為DSM ACC2219)。或者，可采用微載體培養(yǎng)。優(yōu)選用無血清的培養(yǎng)基和/或無蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基培養(yǎng)支持流感病毒復(fù)制的細(xì)胞系。本發(fā)明將其中不含人或動物來源的血清添加劑的培養(yǎng)基稱為無血清培養(yǎng)基。無蛋白質(zhì)應(yīng)理解為表示發(fā)生細(xì)胞增殖的培養(yǎng)基中不含蛋白質(zhì)、生長因子、其它蛋白質(zhì)添加劑和非血清蛋白質(zhì)，但可包含病毒生長所需的蛋白質(zhì)，例如胰蛋白酶或其它蛋白酶。在這種培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞自身可天然含有蛋白質(zhì)。支持流感病毒復(fù)制的細(xì)胞系優(yōu)選在37°C以下生長[64](例如，30-36 °C，或約30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C )，例如在病毒復(fù)制期間。在培養(yǎng)的細(xì)胞中繁殖病毒的方法通常包括以下步驟給培養(yǎng)的細(xì)胞接種待培養(yǎng)的毒株，將受感染的細(xì)胞培養(yǎng)病毒繁殖所需的時(shí)間，例如通過病毒滴度或抗原表達(dá)測定的(如，接種后24-168小時(shí))，收集繁殖的病毒。以病毒和細(xì)胞之比為1:500-1:1，優(yōu)選1:100-1: 5，更優(yōu)選1:50-1:10 (通過PFU或TCID5tl檢測)接種培養(yǎng)的細(xì)胞。可將病毒加入細(xì)胞懸液中，或施加于細(xì)胞單層，病毒于25-40°C，優(yōu)選28-37°C，在細(xì)胞上吸附至少60分鐘，但通常少于300分鐘，優(yōu)選在90-240分鐘之間。可通過凍融或酶促作用除去感染的細(xì)胞培養(yǎng)物(例如，單層)，從而增加了收集的培養(yǎng)上清液中的病毒含量。然后使收集的液體滅活或冷凍保存。以約O. 0001 - 10，優(yōu)選O. 002 - 5，更優(yōu)選O. 001-2的感染復(fù)數(shù)(“m. o. i. ”)感染培養(yǎng)的細(xì)胞。更優(yōu)選以約O. 01的m. ο. i.感染細(xì)胞。感染后30-60小時(shí)收集感染的細(xì)胞。優(yōu)選在感染后34-48小時(shí)收集細(xì)胞。更優(yōu)選在感染后38-40小時(shí)收集細(xì)胞。通常在細(xì)胞培養(yǎng)期間加入蛋白酶(通常是胰蛋白酶)以釋放病毒，可在培養(yǎng)期間的任何合適階段加入蛋白酶。血凝素(HA)是滅活流感疫苗中的主要免疫原,參考HA水平使疫苗劑量標(biāo)準(zhǔn)化,一般通過單向輻射狀免疫擴(kuò)散(SRID)試驗(yàn)檢測。疫苗通常含有約15 μ gHA/毒株，雖然在例如兒童，或流行情況下還可使用較低的劑量。與較高劑量(例如，3X或9X劑量[65、66]) 一樣，已使用了部分劑量，例如V2WPasyg HA/毒株hVdPVUej]。因此，疫苗可包含 O. 1-150 yg HA/ 流感毒株，優(yōu)選 O. 1-50 μ g,例如 O. 1-20 μ g、0. 1-15 μ g、0. 1-10 μ g、0. 1-7. 5 μ g、0. 5-5 μ g，等等。具體的劑量包括，例如約45、約30、約15、約10、約7. 5、約5、約3. 8、約I. 9、約I. 5，等等。與本發(fā)明一樣，當(dāng)疫苗中存在佐劑時(shí)，這些較低的劑量最有用。對于活疫苗，通過中值組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tl)而不是HA含量來檢測給藥，每種毒株的TCID50 一般在IO6-IO8之間(優(yōu)選IO6 5-IO7 5)。本發(fā)明所用的HA可以是病毒中發(fā)現(xiàn)的天然HA，或者可經(jīng)修飾。例如，已知可修飾HA以除去致使病毒在禽類中高度致病的決定簇(例如，圍繞HAl和HA2之間的切割位點(diǎn)的超堿性區(qū)域(hyper-basic region)),否則這些決定簇可阻止病毒在卵中生長。本發(fā)明試劑盒的抗原組分可包含洗滌劑，例如聚氧乙烯失水失水山梨糖醇酯表面活性劑(稱為“吐溫”)，辛苯聚醇(例如，辛苯聚醇_9(曲通X-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)，溴化十六烷基三甲銨(CTAB)，或脫氧膽酸鈉，特別是對于裂解或表面抗原疫苗。可以只存在痕量的洗滌劑。因此，疫苗中所含的辛苯聚醇-10、α-生育酚半琥珀酸酯(a -tocopheryl hydrogen succinate)和聚山梨醇酯80各自低于lmg/ml。其它痕量的殘留組分可以是抗生素(例如，新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。滅活但非全細(xì)胞的疫苗(例如，裂解病毒疫苗或純化的表面抗原疫苗)可包含基質(zhì)蛋白，從而受益于位于該抗原內(nèi)的其它T細(xì)胞表位。因此，包含血凝素和神經(jīng)氨酸酶的非全細(xì)胞疫苗(特別是裂解疫苗)還可包含Ml和/或M2基質(zhì)蛋白。如果存在基質(zhì)蛋白，優(yōu)選包含可檢測水平的M2基質(zhì)蛋白。還可存在核蛋白。不可溶的顆粒佐劑本發(fā)明的組合物和試劑盒包含不可溶的顆粒佐劑。本發(fā)明所用的合適不可溶顆粒佐劑的離子包括但不限于鋁鹽、鈣鹽和微粒。不可溶的顆粒佐劑的功能通常是作為吸附劑，從而能在混合抗原和佐劑時(shí)將抗原(例如，血凝素)能吸附到佐劑上。然而對于微粒，作為將抗原吸附到顆粒表面的替代方法(或者除了將抗原吸附到顆粒表面)，還可能將抗原包裹在顆粒的內(nèi)部。
合適的鋁鹽包括稱為氫氧化鋁和磷酸鋁的佐劑。這些名稱是慣常的，但只是為方便而使用，并未精確描述所存在的實(shí)際化學(xué)構(gòu)成[例如，見參考文獻(xiàn)67的第9章]。本發(fā)明可用常規(guī)用作佐劑的任何“氫氧化物”或“磷酸鹽”佐劑。稱為“氫氧化鋁”的佐劑一般是羥基氧化鋁鹽，其通常至少部分結(jié)晶。羥基氧化鋁以分子式AlO(OH)表示，其與其它鋁化合物，例如氫氧化鋁Al(OH)J^區(qū)別在于紅外(IR)光譜，特別是在1070CI!!—1處存在吸收帶和在3090-3100( ^處存在強(qiáng)烈的肩峰[參考文獻(xiàn)67的第9章]。半峰高處衍射帶的寬度(WHH)反映了氫氧化鋁佐劑的結(jié)晶程度，結(jié)晶不佳的顆粒因晶體尺寸較小而顯示更強(qiáng)的譜線增寬。表面積隨WHH的增加而增加，WHH值較大的佐劑顯示吸附抗原的能力較強(qiáng)。氫氧化鋁佐劑呈典型的纖維形態(tài)(例如，電子透射顯微照片所見的)。氫氧化鋁佐劑的Pl通常約11，即在生理PH下佐劑本身具有表面正電荷。據(jù)報(bào)道，pH7. 4時(shí)，氫氧化鋁佐劑的吸附能力在每mg A1+++1. 8-2. 6mg蛋白質(zhì)之間。稱為“磷酸鋁”的佐劑一般是羥基磷酸鋁，這些佐劑也常含有少量硫酸根(即，羥基磷酸硫酸鋁)。可通過沉淀獲得這些佐劑，沉淀期間的反應(yīng)條件和濃度影響磷酸根取代該 鹽中羥基的程度。羥基磷酸鹽中P04/A1摩爾比通常在O. 3-1. 2之間。羥基磷酸鹽因存在羥基而有別于嚴(yán)格的A1P04。例如，3164CHT1的IR光譜帶(例如，當(dāng)加熱至200°C時(shí))表明存在結(jié)構(gòu)性羥基[參考文獻(xiàn)67的第9章]。磷酸鋁佐劑的P04/A13+摩爾比通常在O. 3-1. 2之間，優(yōu)選在O. 8-1. 2之間，更優(yōu)選0.95±0. I。磷酸鋁通常是無定形的，特別是羥基磷酸鹽。典型的佐劑是P04/A13+摩爾比在O. 84-0. 92之間，含O. 6mg Al3+/ml的無定形羥基磷酸鋁。磷酸鋁通常是顆粒狀的(例如，電子透射顯微照片中所見的平板樣形態(tài))。這些顆粒在吸附任何抗原后的典型直徑是O. 5-20 μ m(例如，約5-10 μ m)。據(jù)報(bào)道，ρΗ7· 4時(shí)，磷酸鋁佐劑的吸附能力在每mgA1+++0. 7-1. 5mg蛋白質(zhì)之間。磷酸鋁的零電荷點(diǎn)(PZC)與磷酸根取代羥基的程度成反比，而該取代程度依據(jù)沉淀制備該鹽所用的反應(yīng)條件和反應(yīng)物濃度而不同。也可通過改變?nèi)芤褐杏坞x磷酸根離子的濃度(磷酸根越多=PZC酸性越高)或通過添加例如組氨酸緩沖液(使得PZC更具堿性)等緩沖液來改變PZC。本發(fā)明所用磷酸鋁的PZC通常在4. 0-7. O之間，更優(yōu)選在5. 0-6. 5之間，例如約5. 7。本發(fā)明所用的鋁鹽懸液可含有緩沖液(例如，磷酸或組氨酸或Tris緩沖液)，但不一定。這些懸液優(yōu)選無菌、無熱原。懸液可含有游離的水性磷酸根離子，例如濃度在1.0-20mM之間、優(yōu)選在5-15mM之間、更優(yōu)選約10mM。這些懸液也可含有氯化鈉。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，佐劑包含氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物[6]。在這種情況中，磷酸鋁可能多于氫氧化鋁，例如重量比至少為2:1，例如彡5: I、彡6: I、彡7: I、彡8: I、^ 9:1，等等。給予患者的組合物中Al+++的濃度優(yōu)選低于10mg/ml,例如< 5mg/ml、i^ 4mg/ml、 3mg/ml、i^ 2mg/ml、i^ lmg/ml,等等。優(yōu)選的范圍在 O. 3-lmg/ml 之間。優(yōu)選最大〈O. 85mg/劑。輕鹽在各種鈣鹽中，通常只用磷酸鈣作為佐劑。現(xiàn)已報(bào)道了磷酸鈣的各種佐劑形式，本發(fā)明可用任何這些形式。
水合磷酸鈣凝膠佐劑可購自丹麥瓦德貝克市的斯由普夫公司(Superfos，Vedbaek, Denmark)。1995年，參考文獻(xiàn)67的第8章總結(jié)了磷酸鈣佐劑。可通過在有抗原存在下原位沉淀該鹽，或通過吸附至預(yù)形成的鹽上而將抗原吸附到磷酸鈣上。述及了預(yù)形成的磷酸鈣凝膠的商品化來源。詳細(xì)給出了沉淀?xiàng)l件對佐劑的物理化學(xué)特征，包括吸附能力的影響。參考文獻(xiàn)68報(bào)道了各種磷酸鈣佐劑的結(jié)構(gòu)和吸附特性。據(jù)報(bào)道，這些佐劑是式Ca1Q_x (HPO4) x (PO4) 6_x (OH) 2_x所示的非化學(xué)計(jì)量羥基磷灰石，而不是嚴(yán)格的Ca3 (PO4) 2，其表面電荷取決于pH，零電荷點(diǎn)(PZC)為5. 5。佐劑可以形成尺寸約IOnmX 150nm的針狀顆粒以及直徑約20-30nm的不規(guī)則形狀的片。參考文獻(xiàn)69披露了含有反應(yīng)活性空位(reactive vacant site)的反應(yīng)活性無定形磷酸I丐，通過使碳酸化的無定形磷酸I丐的碳酸鹽預(yù)組分(pre-component)熱分解成氣態(tài) 或汽化副產(chǎn)物來除去所述預(yù)組分而獲得這些反應(yīng)活性位點(diǎn)。參考文獻(xiàn)70和71披露了顆粒磷酸鈣佐劑(“CAP”)，其中所述顆粒的直徑為300-4000nm (納米顆粒)，形狀為球形，表面平滑。參考文獻(xiàn)72披露這些顆粒可用于粘膜免疫。參考文獻(xiàn)還披露了了粘膜免疫，其中疫苗接種哺乳動物以產(chǎn)生IgA抗體應(yīng)答的方法利用大小適于經(jīng)上皮轉(zhuǎn)運(yùn)的顆粒羥基化磷酸鈣。參考文獻(xiàn)74披露了在體內(nèi)可溶的復(fù)合顆粒，其包含聚合物顆粒，所述顆粒表面包被有Ca/P之比約I. 0-2. O的磷酸鈣化合物。參考文獻(xiàn)75披露了用于吸附疫苗的可注射水性磷酸鈣凝膠，其中鈣離子和磷酸根離子的組合比例使得重量比Ca/P為I. 62-1. 85，從而在20°C當(dāng)每升含O. 07個(gè)Ca原子時(shí)該凝膠的沉淀時(shí)間為10分鐘內(nèi)沉降I-20mm。磷酸鈣佐劑的Ca與P摩爾比可以不同，例如在I. 35-1. 83之間[見參考文獻(xiàn)67的第8章]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)佐劑的吸附特性依據(jù)沉淀期間所用的條件而有所不同，例如緩慢混合所得佐劑的吸附性能低于快速混合形成的佐劑。本發(fā)明疫苗中以Ca++檢測的磷酸鈣含量可以在O. lmg/ml和10mg/ml之間，例如在0. 5_5mg/ml 之間，優(yōu)選 0. 75_3mg/ml、0· 9-1. 5mg/ml 之間或約 lmg/ml。磷酸鈣佐劑能吸附抗原。對于某給定的抗原，以抗原的總重量計(jì)，吸附了至少80% (例如，彡 85%、彡 90%、彡 92. 5%、彡 95%、彡 97. 5%、彡 97. 5%、彡 98%、彡 99%、彡 99. 5%,等等)。由于磷酸鈣佐劑不可溶，采用以下方法可方便地檢測吸附程度，所述方法包括離心然后測定固體或可溶物質(zhì)之一(或二者)中的抗原含量。離心后，未吸附的抗原維持在溶液中。例如，參考文獻(xiàn)76采用該方法檢測了磷酸鈣佐劑的吸附能力。當(dāng)(a)白喉類毒素水平升高到IOOLf以上和(b)破傷風(fēng)類毒素水平升高到25Lf以上時(shí)，將白喉和破傷風(fēng)類毒素吸附到Img Ca++上是不完全的。對于吸附，優(yōu)選利用加入了一種或多種流感抗原的水性懸液形式磷酸鈣佐劑。可先將鈣鹽稀釋至所需濃度再加入抗原。微粒將微粒用作佐劑已見描述，例如見參考文獻(xiàn)77和78。優(yōu)選的微粒由生物可降解和無毒聚合物制成。例如，可用選自下組的聚合物制成聚(α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚己酸內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酐和聚氰基丙烯酸酯。還可利用這些聚合物的共聚物，例如或者D，L-丙交酯和己內(nèi)酯的共聚物。優(yōu)選的聚合物是聚(α-羥酸)，更優(yōu)選選自下組的那些聚(L-丙交酯)、聚(D，L-丙交酯)和聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)。最優(yōu)選的聚合物是稱為“PLG”的聚(D, L-丙交酯-共-乙交酯)聚合物。優(yōu)選的聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)聚合物是丙交酯/乙交酯摩爾比為25:75-75:25，更優(yōu)選40:60-60:40，例如約50:50的那些。含有50%D, L-丙交酯和50%乙交酯的50:50PLG聚合物是快速吸附的聚合物，而因?yàn)楸货シ至吭黾樱?5:25PLG降解較慢，85:15和90:10甚至降解更慢。可獲得各種分子量的這些聚合物，本領(lǐng)域技術(shù)人員不難測定某給定抗原的合適分子量。對于聚交酯，例如合適的分子量是約2000-5000級別的。對于PLG，合適的分子量通常是約 10，000-約 200，000，優(yōu)選約 15，000-約 150，000，最優(yōu)選約 50，000-約 100，000。有用的范圍是30，000道爾頓-70，000道爾頓。 微粒的直徑為約IOOnm-約150nm,更優(yōu)選直徑約200nm_約30 μ m,最優(yōu)選直徑約500nm-約10 μ m。一般它們基本上是球形的。可采用各種方法制備微粒。例如，已知有雙乳液/溶劑蒸發(fā)技術(shù)，該技術(shù)包括形成由聚合物溶液液滴構(gòu)成的初級乳液，隨后與含有顆粒穩(wěn)定劑/表面化學(xué)表面活性劑的連續(xù)液相混合。更具體地說，如參考文獻(xiàn)79中所述，可利用水包油包水(w/o/w)溶劑蒸發(fā)系統(tǒng)形成微粒。在該技術(shù)中，將特定的聚合物與有機(jī)溶劑，例如乙酸乙酯、二氯甲烷、乙腈、丙酮、氯仿等混合。聚合物在有機(jī)溶劑中形成約2-15%，更優(yōu)選約4-10%，最優(yōu)選6%的溶液。利用，例如勻漿器乳化聚合物溶液。然后將乳液與乳液穩(wěn)定劑，例如聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮的大體積水溶液混合。乳液穩(wěn)定劑通常形成約2-15%的溶液，更常見形成約4-10%的溶液。然后勻漿該混合物產(chǎn)生穩(wěn)定的w/o/w雙重乳液。隨后蒸發(fā)有機(jī)溶劑。可調(diào)節(jié)制劑參數(shù)以沉淀小的(<5ym)和大的(>30 μπι)微粒。例如，慢速攪拌可獲得大顆粒，因?yàn)樵龃罅藘?nèi)相體積。可通過常規(guī)方法測定顆粒大小。除了采用雙乳液技術(shù)，還可采用單乳液技術(shù)。還可采用噴霧干燥和凝聚，或通過空氣懸浮包衣技術(shù)，例如鍋包衣和Wurster包衣形成微粒。還可利用離子凝膠。 制備后，可按原樣保存微粒，或可凍干待用。將抗原懸浮到制備的微粒上的一種方法如下所示。利用可透析的洗滌劑將微粒再水合并分散成基本上單體的微粒懸液。有用的洗滌劑包括但不限于各種N-甲基葡糖酰胺(methylglucamide)(稱為MEGA)，例如庚酰基-N-甲基葡糖酰胺(MEGA-7)、辛酰基-N甲基葡糖酰胺(MEGA-8)、壬酰基-N-甲基葡糖酰胺(MEGA-9)和癸酰基-N-甲基葡糖酰胺(MEGA-10);膽酸；膽酸鈉；脫氧膽酸；脫氧膽酸鈉；牛磺酸；牛磺酸鈉；牛磺去氧膽酸(taurodeoxycholic acid);牛磺去氧膽酸鈉；3[(3_膽酰胺(cholamido)丙基)二甲基銨基(dimethylammonio) ]-1_丙磺酸酯(CHAPS) ;3_[ (3-膽酰胺丙基)二甲銨]_2_輕基-I-丙磺酸酯(CHAPSO) ;N-十二烷基-N，N- 二甲基-3-銨基(ammoniol)-丙磺酸酯(ZWITTERGENT3-12) ；N, N-雙-(3-D-葡糖酰氨基丙基(gluconeamidopropyl))-脫氧膽酰胺(deoxycholamide) (DEOXY-BIGCHAP) ;N辛基葡糖苷；鹿糖單月桂酸酯(sucrosemonolaurate);甘氨膽酸/甘氨膽酸鈉；月桂肌氨酸(Iaurosarcosine)(鈉鹽)；葡糖脫氧膽酸(glycodeoxycholic acid)/ 葡糖脫氧膽酸鈉(sodium glycodeoxycholate)。所用的洗滌劑與微粒之比(W:w) —般約為O. 0156:1，更優(yōu)選約O. 625:1，甚至更優(yōu)選約O. 25:1，最優(yōu)選約1:1-2: I。然后物理研磨微粒/洗滌劑混合物，例如使用陶瓷研缽和研棒，直至形成光滑的漿液。然后加入合適的水性緩沖液，例如磷酸緩沖鹽水(PBS)或Tris緩沖鹽水，超聲處理或勻漿得到的混合物直至微粒完全懸浮。隨后向微粒懸液中加入感興趣的抗原，整個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行透析以除去洗滌劑。聚合 物微粒和洗滌劑系統(tǒng)的選擇最好使得感興趣的抗原能吸附到微粒表面同時(shí)仍能維持抗原的活性。可以洗去含有表面吸附抗原的所得微粒的未結(jié)合抗原，將其作為合適緩沖制劑的懸液保存，或用合適的賦形劑凍干，如下文進(jìn)一步描述的。可任選處理微粒以獲得帶負(fù)電荷的表面(例如，用SDS)或帶正電荷的表面(例如，用陽離子洗滌劑，如CTAB)。根據(jù)待吸附的抗原，表面特征變化可改變吸附特征。免疫增強(qiáng)劑本發(fā)明組合物包含免疫增強(qiáng)劑，發(fā)現(xiàn)聯(lián)用免疫增強(qiáng)劑和不可溶的顆粒佐劑獲得了出乎意料有效的免疫原性組合物。優(yōu)選的免疫增強(qiáng)劑是Toll樣受體(TLR)激動劑。例如，它們可以是人TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9蛋白中的一種或多種的激動劑。優(yōu)選的免疫增強(qiáng)劑是TLR7的激動劑(例如，咪唑并喹啉類)和/或更優(yōu)選TLR9的激動劑(例如，CpG寡核苷酸)。這些免疫增強(qiáng)劑可用于活化先天免疫途徑。典型的免疫增強(qiáng)劑是有機(jī)化合物，通常不是聚合物。它們的分子量可低于2kDa，例如 <1800Da、<1600Da、<1400Da、<1200Da、〈lOOODa、<800Da、<600Da、<500Da、<400Da、<300Da或 <200Da。合適的免疫增強(qiáng)劑包括但不限于 免疫刺激性寡核苷酸，例如含CpG基序的寡核苷酸(含有通過磷酯鍵與鳥嘌呤連接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)，或雙鏈RNA，或含回文序列的寡核苷酸或含聚(dG)序列的寡核苷酸。· 3-0-脫酰基單磷酰脂質(zhì) A ( “3dMPL”，也稱為 “MPL ” ) [80-83]。 咪唑并喹啉化合物，例如咪喹莫特(“R837”)[84、85]、瑞喹莫德(“R-848”)[86]和它們的類似物；和它們的鹽(例如，鹽酸鹽)。免疫刺激性咪唑并喹啉的其它細(xì)節(jié)見參考文獻(xiàn)87-91。·縮氨基硫脲化合物，例如參考文獻(xiàn)92披露的那些。參考文獻(xiàn)92還描述了配制、制造和篩選活性化合物的方法。·色胺酮化合物，例如參考文獻(xiàn)93披露的那些。參考文獻(xiàn)93還描述了配制、制造和篩選活性化合物的方法。 核苷類似物，例如(a)艾沙托拉濱(Isatorabine) (ANA-245 ;7_硫雜_8_氧代鳥
苷)及其前藥
jrVVo
wan入I
OO
(b) ANA975 ； (c) ANA-025-1 ； (d) ANA380 ； (e)參考文獻(xiàn) 94-96 所述的化合物；(f)下
式所示化合物
權(quán)利要求
1.一種免疫原性組合物，其包含(i)流感病毒抗原；(ii)不可溶顆粒佐劑；和(iii)免疫增強(qiáng)劑。
2.如權(quán)利要求I所述的組合物，其特征在于，所述流感病毒抗原是滅活病毒。
3.如權(quán)利要求I所述的組合物，其特征在于，所述流感病毒抗原包含完整的病毒、裂解病毒或純化的表面抗原。
4.以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，所述流感病毒抗原來自HI、H2、H3、H5、H7或H9甲型流感病毒亞型。
5.以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，從用細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)的流感病毒制備所述流感病毒抗原。
6.以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，從用卵培養(yǎng)的流感病毒制備所述流感病毒抗原。
7.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，所述組合物不含卵白蛋白、卵類黏蛋白和雞DNA。
8.如權(quán)利要求5或7所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含少于IOng細(xì)胞培養(yǎng)宿主的細(xì)胞DNA。
9.如權(quán)利要求5或7所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含的100個(gè)核苷酸或更長的DNA少于10ng。
10.以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，所述組合物包含O.1-20 μ g血凝素/病毒毒株。
11.以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，所述不可溶顆粒佐劑選自鋁鹽；鈣鹽；和微粒。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述不可溶顆粒佐劑包含氫氧化鋁。
13.如權(quán)利要求11或12所述的組合物，其特征在于，所述不可溶顆粒佐劑包含磷酸鋁。
14.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述不可溶顆粒佐劑包含磷酸鈣。
15.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述不可溶顆粒佐劑包含由聚(丙交酯-共-乙交酯)制成的微粒。
16.以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，所述免疫增強(qiáng)劑是人TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9中的一種或多種的激動劑。
17.以上任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的組合物，其特征在于，所述免疫增強(qiáng)劑是免疫刺激性寡核苷酸。
18.不可溶顆粒佐劑；和(iii)免疫增強(qiáng)劑。
19.一種制備免疫原性組合物的方法，所述方法包括混合以下組分的步驟(i)流感病毒抗原；(ii)不可溶顆粒佐劑；和(iii)免疫增強(qiáng)劑。
20.一種裝有以下組分的試劑盒(i)包含流感病毒抗原的第一試劑盒組分；和(ii)包含不可溶顆粒佐劑的第二試劑盒組分，其中(a)所述第一組分或所述第二組分包含免疫增強(qiáng)劑，或(b)所述試劑盒裝有包含免疫增強(qiáng)劑的第三試劑盒組分。
全文摘要
發(fā)現(xiàn)含有不可溶顆粒佐劑的流感疫苗能引發(fā)主要是TH2應(yīng)答(IgG1)的IgG應(yīng)答。通過在組合物中加入免疫增強(qiáng)劑可使該應(yīng)答向TH1應(yīng)答(IgG2a)轉(zhuǎn)變。因此，本發(fā)明提供包含以下組分的免疫原性組合物(i)流感病毒抗原；(ii)不可溶顆粒佐劑；和(iii)免疫增強(qiáng)劑。
文檔編號A61K39/39GK102727885SQ20121022360
公開日2012年10月17日 申請日期2006年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月4日
發(fā)明者D·奧黑根, G·德爾古迪斯, R·拉普奧里 申請人:諾華疫苗和診斷有限公司